黃艷明，楊 梅，袁容娣

目的：探討低溫瓊脂包埋振動切片機切片法制作的大鼠視網(wǎng)膜切片內(nèi)核層神經(jīng)元的形態(tài)和基本電生理學(xué)特性。

方法：采用低溫瓊脂包埋振動切片機切片的方法制作大鼠視網(wǎng)膜切片，對內(nèi)核層的神經(jīng)元進(jìn)行膜片鉗全細(xì)胞記錄，同時在胞內(nèi)液中加入熒光黃觀察記錄細(xì)胞的形態(tài)。

結(jié)果：該方法制作的視網(wǎng)膜切片切面平整、細(xì)胞活性好、保留了細(xì)胞之間的突起聯(lián)系，能夠根據(jù)細(xì)胞胞體的大小、位置初步辨別細(xì)胞的種類。在視網(wǎng)膜切片上熒光黃顯示的細(xì)胞形態(tài)表明，雙極細(xì)胞胞體呈梭形，突起主要沿縱向延伸；而水平細(xì)胞和無長突細(xì)胞胞體圓形或橢圓形、胞體較大，分別位于內(nèi)核層的最外層和最內(nèi)層。水平細(xì)胞和無長突細(xì)胞的靜息膜電位(RMP)和膜電容(Cm)明顯高于雙極細(xì)胞。給予時程40ms，步階10mV從-60mV至+40mV的電壓刺激，41.7%的視錐雙極細(xì)胞和64.7%的無長突細(xì)胞表現(xiàn)出內(nèi)向鈉電流和外向鉀電流，其他細(xì)胞則只表現(xiàn)出外向鉀電流。

結(jié)論：采用低溫瓊脂包埋振動切片機切片的方法操作簡單，制作的切片質(zhì)量穩(wěn)定可靠，使得在視網(wǎng)膜切片上對包括水平細(xì)胞在內(nèi)的不同內(nèi)核層神經(jīng)元進(jìn)行膜片鉗記錄成為可能。進(jìn)一步研究視網(wǎng)膜內(nèi)核層神經(jīng)元的電生理學(xué)特性，有助于揭示視覺信號的發(fā)生、傳導(dǎo)和調(diào)控機制。

0 引言

視網(wǎng)膜主要由三層細(xì)胞構(gòu)成，從外至內(nèi)依次為外核層、內(nèi)核層(inner nuclear layer, INL)和節(jié)細(xì)胞層。其中INL的細(xì)胞種類復(fù)雜，包括水平細(xì)胞(horizontal cell, HC)、視桿雙極細(xì)胞(rod bipolar, RB)、視錐雙極細(xì)胞(cone bipolar, CB)和無長突細(xì)胞(amacrine cell, AC)。且在視覺信息的傳遞過程中擔(dān)當(dāng)承上啟下的重要功能，雙極細(xì)胞將接收的光感受器的信號分流為給光(ON)和撤光(OFF)信號；同時經(jīng)感光細(xì)胞—雙極細(xì)胞—神經(jīng)節(jié)細(xì)胞垂直通路傳遞的視覺信號在INL的水平細(xì)胞和無長突細(xì)胞兩個水平進(jìn)行整合；最后通過INL細(xì)胞與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞之間特殊的突觸傳遞，將持續(xù)性的分級電位轉(zhuǎn)化為動作電位。因此對INL細(xì)胞電生理功能的研究對于揭示視網(wǎng)膜的信息處理機制尤為重要。

由于感光細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分別位于視網(wǎng)膜的最外層和最內(nèi)層，對其電生理功能的記錄可在視網(wǎng)膜鋪片上進(jìn)行[1]。而對處于視網(wǎng)膜中間層的INL細(xì)胞如雙極細(xì)胞[2]、無長突細(xì)胞[3]的膜片鉗記錄則只能在視網(wǎng)膜切片上進(jìn)行。但是至今對水平細(xì)胞的膜片鉗記錄仍然采用酶消化、分離單個細(xì)胞的方法[4-5]。究其原因，可能是由于傳統(tǒng)的方法制作的視網(wǎng)膜切片質(zhì)量欠佳，難以辨認(rèn)數(shù)量相對較少的水平細(xì)胞。本研究借用腦片膜片鉗技術(shù)中振動切片機切片的方法，加以改進(jìn)將視網(wǎng)膜用低熔點瓊脂包埋后振動切片機切片，制作出形態(tài)和活性較好的視網(wǎng)膜切片，對INL 的各種神經(jīng)元進(jìn)行膜片鉗全細(xì)胞記錄。

1 材料和方法

1.1材料 選取出生后30d Long Evan’s大鼠(來源于陸軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心)。常規(guī)化學(xué)試劑(NaCl，KCl，CaCl2，MgCl2，NaHCO3，NaH2PO4，葡萄糖，乳酸鈉)購于重慶北碚化學(xué)試劑廠，丙戊酸鈉和熒光黃購于上海生工，低熔點瓊脂(美國Sigma Aldrich)。玻璃微電肌毛胚(北京正天易科貿(mào)有限責(zé)任公司)。主要設(shè)備：膜片鉗放大器(美國Axon公司Axopatch200B)、電極拉制器(美國Sutter公司P-97 Flaming/Brown式)、熒光顯微鏡(德國Leica Q550FW)、振動切片機(美國Ted Pella，INC Vibratome 1000)。

1.2方法

1.2.1視網(wǎng)膜切片的制作 麻醉并處死出生后30d Long Evan’s大鼠，迅速摘出眼球，在細(xì)胞外液(NaCl 119mmol/L，KCl 2.5mmol/L，CaCl22.5mmol/L，MgCl21.3mmol/L，NaHCO326.2mmol/L，NaH2PO41mmol/L，葡萄糖 20mmol/L，丙酮酸鈉 2mmol/L，乳酸鈉 4mmol/L)中剝離視網(wǎng)膜，并將其剪成2～3片。該研究中使用的Long Evan’s 大鼠符合我國微生物控制的要求，實驗設(shè)計、實驗過程及動物處死方法，經(jīng)過陸軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物福利倫理審查委員會審核通過，符合動物倫理和動物福利要求。視網(wǎng)膜片展平后使用37℃的3.5%低熔點瓊脂凝膠包埋，放置冰袋上迅速冷卻凝固后，修整瓊脂塊，使用瞬間粘合劑將其固定在振動切片機(vibratome 1500, 美國)的載物臺上，迅速加入4℃預(yù)冷的細(xì)胞外液并通混合氣體(95%O2+5%CO2)，將包埋有視網(wǎng)膜的瓊脂塊切成厚度200μm的切片，用細(xì)毛筆將切片轉(zhuǎn)移入通混合氣體的細(xì)胞外液中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2記錄電極的制備 應(yīng)用P97電極拉制儀(Sutter, 美國)采用三步法拉制玻璃毛細(xì)管微電極(WPI，美國)，拉制好的電極在注入電極內(nèi)液(KCl 120mmol/L，HEPES 20mmol/L， EGTA 1mmol/L，MgATP 2mmol/L，NaGTP 0.2mmol/L，0.02%熒光黃)后測阻抗為7～10 MΩ。

1.2.3膜片鉗全細(xì)胞記錄 用細(xì)毛筆小心將視網(wǎng)膜切片轉(zhuǎn)移入灌流槽底并用尼龍絲網(wǎng)加以固定，持續(xù)氧飽和的細(xì)胞外液灌流(3～5mL/min)。采用傳統(tǒng)的全細(xì)胞膜片鉗記錄技術(shù)，在電壓鉗模式下，鉗制電壓-60mV，10mV步階階躍至+40mV，記錄細(xì)胞的全細(xì)胞電流。在形成全細(xì)胞模式后，記錄細(xì)胞的被動膜學(xué)特性，包括靜息膜電位(RMP)、膜輸入阻抗(IR)、膜電容(Cm)等。信號采集頻率為10kHz，濾波頻率為2kHz。所用設(shè)備為Axopatch 200-B(Axon Instruments,CA,USA)，信號采集和分析軟件Clampex 10.0和Clampit10.0。采集記錄結(jié)束后在熒光顯微鏡下可以觀察、拍攝所記錄細(xì)胞的形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1視網(wǎng)膜切片的形態(tài) 采用低熔點瓊脂包埋振動切片機方法獲得的視網(wǎng)膜切片，在400×顯微鏡下，切面平整層次清晰，組織透光性好，色素上皮細(xì)胞、感光細(xì)胞及其內(nèi)外節(jié)、INL各種細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均清晰可見(圖1A)。INL的大部分細(xì)胞表面突起隱約可見(圖1B箭頭所示)，且胞體光澤圓滑。在對INL-無長突細(xì)胞記錄完畢觀察細(xì)胞形態(tài)時(圖1C)，我們還發(fā)現(xiàn)節(jié)細(xì)胞層有一細(xì)胞胞體同時著色(圖1D)，且可見兩細(xì)胞之間的突起聯(lián)系(圖1F)。

2.2內(nèi)核層神經(jīng)元的形態(tài) 水平細(xì)胞：胞體位于INL緊鄰?fù)鈪矤顚?outer plexiform layer, OPL)的部位，突起在OPL內(nèi)水平延伸(圖2A)。視桿雙極細(xì)胞：胞體呈梭形，軸突較長，深達(dá)內(nèi)從狀層(inner plexiform layer, IPL)的最內(nèi)層,軸突末端呈瘤樣膨大(圖2B)。視錐雙極細(xì)胞：分為兩種類型，ON型視錐雙極細(xì)胞軸突較長，軸突末端止于IPL層的內(nèi)層(圖2C)；OFF型視錐雙極細(xì)胞胞體位于INL內(nèi)層，軸突較短，末端止于于IPL 的外層(圖2D)。無長突細(xì)胞：胞體較雙極細(xì)胞大，位于INL層最內(nèi)層，突起分支模式多樣(圖2E、F)。

2.3內(nèi)核層神經(jīng)元的基本電生理學(xué)特性 內(nèi)核層視桿雙極細(xì)胞、視錐雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞、無長突細(xì)胞這四種神經(jīng)元的被動膜學(xué)特性檢測結(jié)果顯示，四種神經(jīng)元的IR值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；四種神經(jīng)元的RMP值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中視桿雙極細(xì)胞組(-47.3±2.76mV)和視錐雙極細(xì)胞組(-42.3±5.53mV)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但視桿雙極細(xì)胞組與水平細(xì)胞組(-51.2±4.25mV)、視錐雙極細(xì)胞組與無長突細(xì)胞組(-59.8±3.15mV)相比RMP值均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；四種神經(jīng)元的Cm值檢測比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中視桿雙極細(xì)胞組(28.5±6.12pF)和視錐雙極細(xì)胞組(25.7±3.26pF)相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但視桿雙極細(xì)胞組與水平細(xì)胞組(35.6±4.79pF)、視錐雙極細(xì)胞組與無長突細(xì)胞組(39.3±1.37pF)相比Cm值均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

在同樣的步階電壓刺激下，比較INL各種神經(jīng)元的全細(xì)胞電流。水平細(xì)胞、視桿雙極細(xì)胞、部分視錐雙極細(xì)胞7/12)和部分無長突細(xì)胞(6/17)只表達(dá)外向鉀電流。鉗制電位+40mV時，前三類細(xì)胞外向鉀電流的峰值分別為820.5±137.4 pA(n=7)(圖3A)、648.7±98.3pA(n=15)(圖3B)、672.3±11.5pA(n=7)(圖3C)，而無長突細(xì)胞的外向鉀電流峰值較大可達(dá)2614.5±275.1pA(n=6)(圖3E)。41.7%視錐雙極細(xì)胞(5/12)(圖3D)和64.7%無長突細(xì)胞(11/17)(圖3F)在同上的步階電壓刺激下，同時表現(xiàn)出外向鉀電流和內(nèi)向鈉電流。視錐雙極細(xì)胞內(nèi)向電流的峰值為-252.9±48.6pA(n=5)(圖3D)，而無長突細(xì)胞內(nèi)向電流峰值達(dá)-414.7±73.2pA(n=11)(圖3F)。

圖1 視網(wǎng)膜切片的形態(tài)以及切片上細(xì)胞之間的突起聯(lián)系 A：低溫瓊脂包埋振動切片機制作的視網(wǎng)膜切片切面平整、細(xì)胞活性良好，根據(jù)細(xì)胞胞體的位置和突起形態(tài)可以大致區(qū)分細(xì)胞類型;B:無長突細(xì)胞和它的突起;C:神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層的一個神經(jīng)節(jié)細(xì)胞被染色;D:在像差顯微鏡下看到染色較深的無長突細(xì)胞和染色較淺的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。E:B和C重疊顯示無長突細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的突起交叉重疊。RPE：色素上皮層；PRC：感光細(xì)胞層；ONL：外核層；OPL：外叢狀層；INL：內(nèi)核層；IPL：內(nèi)叢狀層；GCL：神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；RB：視桿雙極細(xì)胞；CB：視錐雙極細(xì)胞；HC：水平細(xì)胞； AC：無長突細(xì)胞；RGC：神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

圖2 完成膜片鉗全細(xì)胞記錄以后，在熒光顯微鏡下觀察內(nèi)核層神經(jīng)元的形態(tài) A:水平細(xì)胞;B:視桿雙極細(xì)胞;C:ON型視錐雙極細(xì)胞;D:OFF型視錐雙極細(xì)胞;E,F:無長突細(xì)胞。

指標(biāo)水平細(xì)胞組(n=7)視桿雙極細(xì)胞組(n=15)視錐雙極細(xì)胞組(n=12)無長突細(xì)胞組(n=17) FPRMP(mV)-51.2±4.25a-47.3±2.76-42.3±5.53-59.8±3.15c2.8140.032IR(MΩ)296±17.8317±40.3303±24.5341±24.17.980.762Cm(pF)35.6±4.79a28.5±6.1225.7±3.2639.3±1.37c3.540.042

注：RMP：靜息膜電位； IR：膜輸入阻抗； Cm：膜電容。aP<0.05vs視桿雙極細(xì)胞；cP<0.05vs視錐雙極細(xì)胞。

3 討論

以往制作視網(wǎng)膜切片的方法包括濾紙貼附手工切片和簡易組織切片機切片[6]。這兩種切片方法也存在以下缺點：(1)可控性和重復(fù)性差。(2)刀片直接切割對細(xì)胞損傷大。本實驗中借用腦片膜片鉗實驗中振動切片機切片的方法，將視網(wǎng)膜用低熔點瓊脂包埋成塊，然后振動切片機切成150～200μm的薄片。該方法與上述兩種方法比較，制作的視網(wǎng)膜切片切面平整、各層細(xì)胞胞體圓滑有光澤，部分細(xì)胞的突起隱約可見，且能夠初步判斷細(xì)胞的種類。

圖3 電壓鉗模式下內(nèi)核層神經(jīng)元全細(xì)胞電流比較 A:水平細(xì)胞;B:視桿雙極細(xì)胞; C, D:視錐雙極細(xì)胞；E,F：無長突細(xì)胞的全細(xì)胞電壓。

Euler等[7]根據(jù)胞體的位置、軸突形態(tài)以及軸突終末的位置將大鼠視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞分為10種類型，包括1種視桿雙極細(xì)胞和9種視錐雙極細(xì)胞。Golgi鍍銀染色和免疫組化染色[8-9]表明視桿雙極細(xì)胞胞體大多位于內(nèi)核層靠近外叢狀層的部位，軸突較長, 深達(dá)內(nèi)叢狀層的最內(nèi)層，末端呈瘤樣膨大。內(nèi)叢狀層平均分為五等分，靠近內(nèi)核層的兩等分被稱作a亞層，靠近節(jié)細(xì)胞層的三等分被稱為b亞層，分別對應(yīng)為ON和OFF亞層，視桿雙極細(xì)胞的軸突末梢終止于b亞層[10]。在大多哺乳動物的視網(wǎng)膜中[11-12]，根據(jù)軸突末梢的分支模式和終止的部位劃分存在9種視錐雙極細(xì)胞。 其中軸突末梢終止于內(nèi)從狀層b亞層的屬于ON型視錐雙極細(xì)胞，終止于a亞層的屬于OFF型視錐雙極細(xì)胞。在膜片鉗記錄的胞內(nèi)液中加入0.02%熒光黃，記錄完畢后觀察細(xì)胞形態(tài)，由于雙極細(xì)胞的軸突主要沿縱向延伸，在視網(wǎng)膜切片上可根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步鑒定記錄細(xì)胞所屬的亞型。在活性較好的視網(wǎng)膜切片上，雙極細(xì)胞胞體大多成梭形，視桿雙極細(xì)胞較視錐雙極細(xì)胞略大，更靠近外叢狀層，有時可見較長的軸突深入內(nèi)從狀層。

大多數(shù)脊椎動物視網(wǎng)膜包含兩種基本類型的水平細(xì)胞，一種是沒有軸突的A型水平細(xì)胞，含有相對大而分支少的初級樹突，另一種是有軸突的B型水平細(xì)胞，有較多的樹突。在形態(tài)和活性較好的視網(wǎng)膜切片上，根據(jù)水平細(xì)胞位于INL最外層的特點，不難找到水平細(xì)胞，但是由于該類細(xì)胞的突起只在OPL內(nèi)橫向延伸，故難以在切片上進(jìn)一步區(qū)分A型和B型水平細(xì)胞。無長突細(xì)胞的分型更為復(fù)雜[13-14]，在視網(wǎng)膜切片上難以確切區(qū)分其亞型，必須結(jié)合免疫組化染色和鋪片中的形態(tài)來進(jìn)一步區(qū)分。在本實驗活性較好的視網(wǎng)膜切片上，水平細(xì)胞和無長突細(xì)胞胞體較大，呈圓形或橢圓形，前者位于INL的最外層，后者位于INL的最內(nèi)層。在實驗中對INL-無長突細(xì)胞記錄完畢觀察形態(tài)時，發(fā)現(xiàn)節(jié)細(xì)胞層有一細(xì)胞著色，且可見二者之間的突起聯(lián)系，這更進(jìn)一步說明該切片方法在較大程度上保留了細(xì)胞之間的突起聯(lián)系，更接近生理狀態(tài)。與腦片不同，由于視網(wǎng)膜組織疏松，有些細(xì)胞胞體較小，全細(xì)胞記錄完畢后移走電極通常會把細(xì)胞帶走，電極保持原位稍影響細(xì)胞形態(tài)的觀察。

在INL神經(jīng)元中，無長突細(xì)胞和水平細(xì)胞的RMP和Cm與兩種雙極細(xì)胞有顯著差異；而視錐和視桿雙極細(xì)胞的RMP和Cm沒有顯著差異。Cm的大小與細(xì)胞膜表面積(包括內(nèi)陷折疊部分)成正比，無長突細(xì)胞和水平細(xì)胞Cm值較大，這與這兩種細(xì)胞胞體較大相一致。兩種雙極細(xì)胞在形態(tài)和細(xì)胞大小方面都比較接近，所以它們的RMP和Cm值接近。INL神經(jīng)元在時程40ms，步階10mV從-60mV至+40mV的電壓刺激下，水平細(xì)胞和視桿雙極細(xì)胞僅表現(xiàn)出外向鉀電流。而41.7%的視錐雙極細(xì)胞和64.7%的無長突細(xì)胞同時表現(xiàn)出內(nèi)向電流和外向電流。對不同種屬動物視網(wǎng)膜水平細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，一種獨特的內(nèi)向整流鉀通道可作為水平細(xì)胞的電生理標(biāo)志[15-16]，該電流由超極化電壓所誘發(fā)，本實驗中只設(shè)計了去極化電壓故未能觀察到該標(biāo)志性電流。電壓門控鈉通道通常表達(dá)于以動作電位作為信號傳遞方式的神經(jīng)細(xì)胞，而本實驗發(fā)現(xiàn)在去極化電壓刺激下，部分視錐雙極細(xì)胞和無長突細(xì)胞表現(xiàn)出內(nèi)向電流。這與Pan等[17]對視錐雙極細(xì)胞電壓門控通道的研究結(jié)果一致。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，無長突細(xì)胞雖然是中間神經(jīng)元，但是注入電流使其去極化通常能誘發(fā)出尖峰樣的位電反應(yīng)(spike-like potential)[18]，本實驗中觀察到的電壓門控的內(nèi)向電流可能參與該尖峰樣電位反應(yīng)的產(chǎn)生。

本文所采用的方法制作的視網(wǎng)膜切片切面平整、細(xì)胞活性好，根據(jù)胞體大小、位置等可初步辨認(rèn)包括水平細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞，便于進(jìn)行膜片鉗全細(xì)胞記錄。且該方法制作的切片較大程度的保留了細(xì)胞之間的突起聯(lián)系，可用于研究內(nèi)層細(xì)胞的突觸后反應(yīng)和對光反應(yīng)等。INL的水平細(xì)胞、視桿雙極細(xì)胞、視錐雙極細(xì)胞和無長突細(xì)胞，同為中間神經(jīng)元，形態(tài)和電生理學(xué)特性卻各異。進(jìn)一步研究這些細(xì)胞的離子通道表達(dá)和動力學(xué)特征，有助于揭示視網(wǎng)膜信息處理的機制。