石志康 張勝利 趙敏利 杜昆峰 李瀘平 張 謙 范應(yīng)中

先天性尿道下裂、尿道損傷、尿道狹窄等是泌尿外科常見(jiàn)病，其有效解決辦法仍然依賴(lài)于外科手術(shù)治療，而尿道成形及重建術(shù)是其主要的治療方式。然而，對(duì)于長(zhǎng)段尿道缺損、尿道狹窄及復(fù)雜型尿道損傷的患兒而言，術(shù)后出現(xiàn)尿瘺、尿道狹窄等并發(fā)癥的情況仍然較多[1]。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，近年來(lái)，脂肪干細(xì)胞(adipose derived stem cell,ADSCs)和血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell,VEC)分別單獨(dú)或聯(lián)合支架材料用來(lái)修復(fù)尿道的研究報(bào)道逐漸增多，并取得了一定效果。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建ADSCs聯(lián)合VEC共培養(yǎng)復(fù)合支架材料，初步探討其在組織工程尿道重建中的應(yīng)用，以期為今后尿道成形及重建術(shù)提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

收集新西蘭成年雄性大白兔50只，體重2.5～3.0 kg。由河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

二、儀器與試劑

10%水合氯醛(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院試劑科)、優(yōu)質(zhì)胎牛血清、DMEM低糖培養(yǎng)基/MEM高糖培養(yǎng)基、PBS緩沖液、F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、EDTA(Gibco公司，USA)、青霉素、鏈霉素(華北制藥集團(tuán)有限公司)、硫酸慶大霉素(安陽(yáng)九州藥業(yè)有限責(zé)任公司)、膠原酶Ⅰ(Sigma USA)、98%無(wú)水乙醇(上海化學(xué)試劑廠)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)鼠抗兔單抗、平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)鼠抗兔單克隆抗體(北京博奧森試劑公司)、超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、一次性細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Hyclone公司)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO,日本)、倒置顯微鏡(LEICA德國(guó))、微量移液槍(Gilson,USA)、人真皮脫細(xì)胞基質(zhì)材料(清源偉業(yè)生物科技有限公司)。

三、方法

(一)細(xì)胞的分離培養(yǎng)

1. 脂肪干細(xì)胞(ADSCs)的分離培養(yǎng)：取1只雄性成年新西蘭白兔，右側(cè)腹股溝區(qū)備皮，10%水合氯醛(1 mL/kg)經(jīng)兔耳緣靜脈緩慢推注麻醉白兔，應(yīng)用絡(luò)合碘及75%乙醇消毒右側(cè)腹股溝區(qū)。在無(wú)菌條件下取兔右側(cè)腹股溝區(qū)約1.5 cm×2.0 cm大小的皮膚，立即放入4℃低糖DMEM培養(yǎng)基中以作備用。嚴(yán)格縫合創(chuàng)面，每日給予2次青霉素針25萬(wàn)單位肌肉注射，連續(xù)注射4 d。將取得的脂肪組織在超凈工作臺(tái)上經(jīng)過(guò)處理后，加入含有Ⅳ型膠原酶的DMEM，在37℃的條件下，通過(guò)震蕩消化45 min。然后采用等量含有10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液用來(lái)中和膠原酶組織，200目濾網(wǎng)過(guò)濾后，按照2 200 r/min離心15～20 min。將離心管底部細(xì)胞團(tuán)接種到10%的低糖DMEM培養(yǎng)基的透氣培養(yǎng)瓶中。選擇37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。每2～3 d進(jìn)行換液。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞情況，當(dāng)原代細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)至第三代。

2. 血管內(nèi)皮細(xì)胞的提取、培養(yǎng)及鑒定：取1只雄性成年新西蘭白兔無(wú)菌環(huán)境下獲取兔胸主動(dòng)脈，將動(dòng)脈管腔內(nèi)外用PBS緩沖液反復(fù)沖洗，目的是將附壁血細(xì)胞完全去除，筋膜和多余脂肪剪除后再將血管置入不含血清DMEM培養(yǎng)基器皿中，血管組織經(jīng)剪刀充分剪碎至約1 mm3大小，將其轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置于37℃培養(yǎng)箱，約4 h后，見(jiàn)組織塊充分緊貼于培養(yǎng)板，再加入含15%胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基于培養(yǎng)板中，然后將培養(yǎng)板放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后將培養(yǎng)基完全更換，清除未貼壁的細(xì)胞及雜質(zhì)，以后每3 d將一半培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基。約10～14 d后，觀察細(xì)胞情況，鋪滿約90%培養(yǎng)瓶底后，用0.25%胰酶-0.02% EDTA 消化，按1 ∶2傳代培養(yǎng)，依次傳代培養(yǎng)4周。

3. ADSCs和VEC體外共培養(yǎng)：取第3代ADSCs，濃度2.5×104個(gè)/mL和培養(yǎng)4周VECs，濃度2.5×104個(gè)/mL，將ADSCs與VECs均勻混合后，按1 ∶1比例置入6孔板中進(jìn)行接觸式共培養(yǎng)，每孔加入10%FBS的L-DMEM1.5 mL，每隔1天換液，置于37℃、5%CO2級(jí)飽和濕度培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)。倒置顯微鏡下分別于7 d、14 d觀察聯(lián)合細(xì)胞的形態(tài)變化。

(二)細(xì)胞與材料的復(fù)合

1. 材料的處理：ADSCs和VEC及二者共培養(yǎng)細(xì)胞接種前72 h，在無(wú)血清培養(yǎng)的6孔版中浸泡基質(zhì)材料，更換培養(yǎng)液時(shí)間為隔天1次。用移液槍在細(xì)胞種植前24 h將6孔板內(nèi)的培養(yǎng)液吸干，另外再將50 μL血清在材料兩側(cè)涂抹均勻后以作備用。

2. 細(xì)胞接種：將ADSCs及VEC二者共培養(yǎng)細(xì)胞用0.02%乙二胺四乙酸+0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化后，經(jīng)過(guò)1 000 r/min離心5 min，加1 mL完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞混懸液。在2 cm×2 cm基質(zhì)材料的黏膜一面均勻滴加制備好的細(xì)胞懸液100 μL，將其保存在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱4 h。對(duì)照組采取同樣的方法進(jìn)行處理。

(三)建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及分組

1. 建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型：將剩余48只實(shí)驗(yàn)兔固定后于耳緣靜脈注入10%水合氯醛(/kg)進(jìn)行麻醉。麻醉完成后，取平臥位，會(huì)陰區(qū)備皮后，常規(guī)消毒、鋪巾。經(jīng)尿道外口留置6號(hào)雙腔導(dǎo)尿管進(jìn)行導(dǎo)尿，陰莖頭處縫牽引線固定尿管(圖1A)，配制慶大霉素鹽水經(jīng)尿管外口進(jìn)行膀胱沖洗。尿管可作為兔子尿道支撐，用尖刀片沿陰莖腹側(cè)中段切開(kāi)一長(zhǎng)約3.0 cm切口，依次切開(kāi)各層組織，將實(shí)驗(yàn)所需局部尿道組織充分游離暴露，眼科剪剪除長(zhǎng)約2.0 cm尿道，完成缺損尿道模型的制作(圖1B)。

2. 對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行分組：采用隨機(jī)數(shù)字表法將上述48只體重2.0～2.5 kg新西蘭成年雄性兔分為4組，每組12只。無(wú)細(xì)胞對(duì)照組為單采用真皮脫細(xì)胞基質(zhì)材料修復(fù)組； ADSCs組為復(fù)合有ADSCs的脫細(xì)胞基質(zhì)材料修復(fù)組；VEC組為復(fù)合有VEC的脫細(xì)胞基質(zhì)材料修復(fù)組；ADSCs與VEC共培養(yǎng)組為復(fù)合有ADSCs和VEC二者共培養(yǎng)細(xì)胞的脫細(xì)胞基質(zhì)材料修復(fù)組。

圖1 動(dòng)物模型制作及尿道手術(shù) A：術(shù)前固定尿管； B：術(shù)前尿道缺損動(dòng)物模型的制作； C：術(shù)后成形尿道外觀

Fig.1 Animal modeling and urethral operative pictures

(四)尿道修復(fù)的手術(shù)操作與術(shù)后管理

1. 尿道修復(fù)的手術(shù)方法：無(wú)細(xì)胞對(duì)照組將備用的脫細(xì)胞基質(zhì)材料包裹在尿管外表面，修剪邊緣使其呈管狀結(jié)構(gòu)，然后用6-0可吸收縫線縫合材料邊緣。將人為形成的尿道缺損端與制成的管狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行端端吻合并用6-0可吸收縫線進(jìn)行縫合(圖1C)。檢查手術(shù)區(qū)未見(jiàn)明顯活動(dòng)性出血后，將陰莖腹側(cè)皮下、皮膚組織依次間斷縫合。距尿道外口約1.0 cm處將尿管剪斷并用縫線將其固定于尿道外口處。為預(yù)防傷口感染，手術(shù)區(qū)域傷口用慶大霉素鹽水進(jìn)行沖洗。ADSCs組將載有ADSCs的基質(zhì)材料與缺損尿道進(jìn)行斷端吻合后用6-0可吸收縫線做縫合，其余手術(shù)步驟同無(wú)細(xì)胞對(duì)照組。VEC組將載有VEC的基質(zhì)材料與缺損尿道進(jìn)行斷端吻合后用6-0可吸收縫線做縫合，其余手術(shù)步驟同無(wú)細(xì)胞對(duì)照組。ADSCs與VEC共培養(yǎng)組將載有ADSCs和VEC二者共培養(yǎng)細(xì)胞的基質(zhì)材料與缺損尿道進(jìn)行斷端吻合后用6-0可吸收縫線做縫合，其余手術(shù)步驟同無(wú)細(xì)胞對(duì)照組。

2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的術(shù)后管理：術(shù)后每天給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肌肉注射2次50萬(wàn)單位青霉素鈉針，手術(shù)傷口區(qū)域每日給予絡(luò)合碘進(jìn)行局部消毒清洗，連續(xù)給予慶大霉素沖洗傷口，第14天時(shí)觀察尿管支撐管情況，并將其拔出。為避免局部傷口污染情況，需要及時(shí)清理動(dòng)物的糞便及周?chē)溆嚯s物。

(五)術(shù)后主要觀察項(xiàng)目

1. 種子細(xì)胞及支架材料觀察：ADCSs、VEC及共培養(yǎng)細(xì)胞三者各自的形態(tài)學(xué)及其在培養(yǎng)過(guò)程中的生長(zhǎng)特征情況。

2. 新生尿道標(biāo)本的觀察：術(shù)后2、4、8周時(shí)對(duì)各組重建尿道進(jìn)行觀察，分別從每組中取2只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物切取其尿道標(biāo)本后觀察尿道腔面情況。通過(guò)尿道標(biāo)本截面的HE染色觀察尿道黏膜上皮再生情況，通過(guò)FⅧ、a-SMA免疫組化觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞及尿道平滑肌細(xì)胞再生情況。各組平均血管數(shù)目/視野、平均平滑肌數(shù)目/視野可于術(shù)后8周時(shí)在顯微鏡下觀察，并比較各組間有無(wú)差別。

3. 術(shù)后相關(guān)并發(fā)癥的情況：對(duì)各組動(dòng)物在術(shù)后8周時(shí)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物排尿情況。使用外力作用于動(dòng)物下腹部促使其排尿，觀察有無(wú)尿瘺、尿道狹窄等并發(fā)癥發(fā)生。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究采用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與分析，對(duì)于各組間并發(fā)癥發(fā)生率的比較采用χ2檢驗(yàn)；對(duì)于各組尿道經(jīng)過(guò)VEGF及a-SMA免疫組化染色陽(yáng)性指標(biāo)數(shù)目等計(jì)量資料采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M(P25～P75)]表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、ADSCs的形態(tài)及生長(zhǎng)特征

ADSCs的原代細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)開(kāi)始貼壁的時(shí)間較早，培養(yǎng)2.5 h時(shí)即開(kāi)始貼壁；第2天可見(jiàn)貼壁細(xì)胞數(shù)量較多，以多角形或小梭形細(xì)胞居多，另外還有一些血細(xì)胞夾雜在兩者之間；第3天時(shí)進(jìn)行換液，未貼壁的細(xì)胞被清除后，可見(jiàn)ADSCs存在許多呈多角形或長(zhǎng)梭形的突起，其中一些區(qū)域可見(jiàn)簇狀生長(zhǎng)；第4天細(xì)胞增殖較迅速，第6～7天時(shí)培養(yǎng)瓶底部幾乎被細(xì)胞鋪滿，需要進(jìn)行傳代。經(jīng)傳代后脂肪干細(xì)胞增殖速度更快，80%培養(yǎng)瓶底面積在3～5 d時(shí)間內(nèi)即可被細(xì)胞鋪滿，細(xì)胞密度達(dá)到一定程度時(shí)，可見(jiàn)其呈現(xiàn)出漩渦狀、放射狀或平行狀，并且排列比較紊亂的情況很少見(jiàn)。第3代ADSCs可見(jiàn)均勻一致，類(lèi)似于成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。

二、VEC的形態(tài)及生長(zhǎng)特征

原代內(nèi)皮細(xì)胞大約16 h開(kāi)始貼壁，細(xì)胞最初分離時(shí)形態(tài)多為圓形或橢圓形，有著較強(qiáng)的立體感和折光性，呈小團(tuán)聚集；7 d時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞長(zhǎng)滿單層，細(xì)胞排列較緊密，多角形特別顯著。

三、共培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)特征

ADSCs與VEC按1 ∶1進(jìn)行共培養(yǎng)第1天時(shí)，細(xì)胞數(shù)量之間無(wú)明顯區(qū)別。第2天時(shí)，VEC細(xì)胞增長(zhǎng)速度明顯增加，于1～3 d時(shí)細(xì)胞數(shù)量呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，3 d后達(dá)到平臺(tái)期。ADSCs在1～5 d時(shí)增長(zhǎng)速度較明顯，5 d時(shí)達(dá)到平臺(tái)期。ADSCs長(zhǎng)梭形未發(fā)生明顯變化，且其體積較大；而VEC體積則較小，細(xì)胞性狀呈鵝卵石狀，細(xì)胞間生長(zhǎng)相互影響，且未見(jiàn)明顯細(xì)胞排斥及吞噬情況的發(fā)生。共培養(yǎng)7 d時(shí)部分細(xì)胞仍保留原有的梭形，另外一部分細(xì)胞形態(tài)不同于前者，可呈多角形、巢樣分布(圖2A)，14 d時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞間存在許多相互連接的突觸，并且部分細(xì)胞可融合成團(tuán)塊狀(圖2B)。

圖2 共培養(yǎng)細(xì)胞鏡下觀 A：共培養(yǎng)7 d時(shí)細(xì)胞鏡下觀(200×)； B共培養(yǎng)14 d時(shí)細(xì)胞鏡下觀(400×)

Fig.2 Microscopic observation of cell co-culturing

四、尿道標(biāo)本的大體觀及組織學(xué)觀察

術(shù)后1周：各實(shí)驗(yàn)組尿道修復(fù)區(qū)域未完全愈合，無(wú)明顯傷口感染及切口處縫線脫落情況，尿道修復(fù)區(qū)域與周?chē)Ｆつw間的界限仍較明顯。術(shù)后4周：各實(shí)驗(yàn)組尿道修復(fù)區(qū)域已基本愈合，局部縫線可見(jiàn)脫落，尿道修復(fù)區(qū)域與周?chē)Ｆつw趨向一致。術(shù)后4周、8周分別對(duì)各組兔子尿道行免疫組織化學(xué)染色分析(圖3,圖4)，可見(jiàn)ADSCs與VEC共培養(yǎng)組上皮血管內(nèi)皮細(xì)胞因子(VEGF)、平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)明顯多于無(wú)細(xì)胞對(duì)照組、ADSCs組、VEC組(表1)。

圖3 術(shù)后第4周尿道組織VEGF和a-SMA染色圖 A：術(shù)后第4周ADSCs組再造尿道VEGF因子免疫組化檢查(200×)； B：術(shù)后第4周VEC組再造尿道VEGF因子免疫組化檢查(200×)； C：術(shù)后第4周ADSCs與VEC共培養(yǎng)組再造尿道VEGF因子免疫組化檢查(200×)； D：術(shù)后第4周ADSCs組再造尿道a-SMA免疫組化檢查(200×)； E：術(shù)后第4周VEC組再造尿道a-SMA免疫組化檢查(200×)； F：術(shù)后第4周ADSCs與VEC共培養(yǎng)組再造尿道a-SMA免疫組化檢查(200×)

Fig.3 VEGF and a-SMA staining of urethral tissue at 4 weeks post-operation

圖4 術(shù)后第8周尿道組織VEGF和a-SMA染色圖 A：術(shù)后第8周ADSCs組再造尿道VEGF因子免疫組化檢查(200×)； B：術(shù)后第8周VEC組再造尿道VEGF因子免疫組化檢查(200×)； C：術(shù)后第8周ADSCs與VEC共培養(yǎng)組再造尿道VEGF因子免疫組化檢查(200×)； D：術(shù)后第8周ADSCs組再造尿道a-SMA免疫組化檢查(200×)； E：術(shù)后第8周VEC組再造尿道a-SMA免疫組化檢查(200×)； F：術(shù)后第8周ADSCs與VEC共培養(yǎng)組再造尿道a-SMA免疫組化檢查(200×)

Fig.4 VEGF and a-SMA staining of urethral tissue at 8 weeks post-operation

表1 術(shù)后第8周各組尿道經(jīng)過(guò)VEGF及a-SMA免疫組化染色陽(yáng)性指標(biāo)數(shù)目(個(gè)/HPE)[M,(P25,P75)]Table 1 Number of VEGF and a-SMA immunohistochemical staining positive indicators in urethra of each group at 8 weeks post-operation[M,(P25,P75)]分組VEGFa-SMA無(wú)細(xì)胞對(duì)照組9.00(7.25～11.75)10.50(8.00～13.00)ADSCs組12.00(10.25～13.75)15.00(13.00～17.75)VEC組16.50(14.25～18.00)18.00(16.25～19.00)ADSCs與VEC共培養(yǎng)組18.50(17.25～19.75)19.50(17.25～21.75)χ2值36.431.3P值<0.001<0.001 注 各組VEGF相比后發(fā)現(xiàn),無(wú)細(xì)胞對(duì)照組與VEC組、無(wú)細(xì)胞對(duì)照組與ADSCs與VEC共培養(yǎng)組、ADSCs組與ADSCs與VEC共培養(yǎng)組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0083),無(wú)細(xì)胞對(duì)照組與AD-SCs組、ADSCs組與VEC組、VEC組與ADSCs與VEC共培養(yǎng)組之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.0083)。各組a-SMA相比后發(fā)現(xiàn),無(wú)細(xì)胞對(duì)照組與ADSCs組、無(wú)細(xì)胞對(duì)照組與VEC組、無(wú)細(xì)胞對(duì)照組與ADSCs與VEC共培養(yǎng)組、ADSCs組與ADSCs與VEC共培養(yǎng)組之間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0083),ADSCs組與VEC組、VEC組與ADSCs與VEC共培養(yǎng)組之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.0083)

五、術(shù)后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的排尿情況

術(shù)后第8周通過(guò)人為使用外力作用于動(dòng)物下腹部促使其排尿，評(píng)估尿道狹窄和尿瘺發(fā)生率情況。無(wú)細(xì)胞對(duì)照組動(dòng)物出現(xiàn)并發(fā)癥9只(其中尿瘺6只，尿道狹窄3只)。ADSCs組、VEC組和ADSCs與VEC共培養(yǎng)組出現(xiàn)并發(fā)癥數(shù)量分別為5只(其中尿瘺3只，尿道狹窄2只)、4只(其中尿瘺3只，尿道狹窄1只)、2只(其中尿瘺2只)。并發(fā)癥的發(fā)生率ADSCs組41.7%(5/12)，VEC組33.3%(4/12)，ADSCs與VEC共培養(yǎng)組16.7%(2/12)，明顯低于無(wú)細(xì)胞對(duì)照組的75%(9/12)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.914，P<0.05)。進(jìn)一步兩兩比較，無(wú)細(xì)胞對(duì)照組與ADSCs與VEC共培養(yǎng)組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0083)。無(wú)細(xì)胞對(duì)照組與ADSCs組、無(wú)細(xì)胞對(duì)照組與VEC組、ADSCs組與VEC組、ADSCs組與ADSCs與VEC共培養(yǎng)組及VEC組與ADSCs與VEC共培養(yǎng)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.0083),見(jiàn)表2。

表2 各組術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率比較[n(%)]Table 2 Comparing the incidence of postoperative complications in all groups[n(%)]分組有并發(fā)癥無(wú)并發(fā)癥χ2值P值無(wú)細(xì)胞對(duì)照組ADSCs組VEC組ADSCs與VEC共培養(yǎng)組9(75.0)5(41.7)4(33.3)2(16.7)3(25.0)7(58.3)8(66.7)10(83.3)8.9140.03

討 論

尿道下裂的發(fā)生隨著環(huán)境的變化及污染情況的加重而呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，其發(fā)病率在男性新生兒中可達(dá)到3/1 000，且重度尿道下裂所占比例較大[2]。由相關(guān)報(bào)道可知，在美國(guó)每年需要行尿道手術(shù)的患兒可達(dá)50 000余例[3]。對(duì)于復(fù)雜尿道損傷和尿道缺損較長(zhǎng)的病例，獲得足夠的組織來(lái)進(jìn)行尿道重建是該類(lèi)手術(shù)成功的關(guān)鍵因素，這成為泌尿外科的難題之一[4]。為解決這一難題，目前采用較多的方法是將自體干細(xì)胞種植到脫細(xì)胞基質(zhì)上制成人工尿道，然后再進(jìn)行尿道修復(fù)。到目前為止，研究者把可用的自身組織材料都做了嘗試，包括輸尿管、動(dòng)靜脈、闌尾等管腔樣組織和包皮、頰黏膜、陰囊皮膚、口腔黏膜等上皮樣組織[5，6]。然而，此類(lèi)方法存在缺點(diǎn)，其進(jìn)行尿道重建是以損害自體其他部位組織為代價(jià)。

組織工程學(xué)的出現(xiàn)為尿道修復(fù)材料來(lái)源的難題提供了一種全新的解決思路[7]。組織工程的研究方法多種多樣，但其基本要素是不變的，包括： ①培養(yǎng)種子細(xì)胞； ②制備所需的支架材料； ③細(xì)胞與支架材料之間相互作用和構(gòu)建功能性組織[8]。脂肪干細(xì)胞來(lái)源較廣泛、取材方便，并且給病人帶來(lái)的痛苦比較少。有研究發(fā)現(xiàn)在尿道修復(fù)時(shí)采用接種有種子細(xì)胞的基質(zhì)材料可以產(chǎn)生較為理想的效果，能夠降低尿瘺、尿道狹窄等并發(fā)癥的發(fā)生率[9]。脂肪干細(xì)胞來(lái)源較廣泛,取材方便,再生能力較強(qiáng)。隨著研究的不斷深入，ADSCs成功應(yīng)用于尿道缺損修復(fù),為組織工程在尿道修復(fù)重建中的應(yīng)用積累了一定經(jīng)驗(yàn)[10]。血管內(nèi)皮細(xì)胞是一種多功能細(xì)胞，位于血管內(nèi)壁。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床資料表明，VEC在改善機(jī)體缺血部位和損傷部位的血供方面有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新生血管的增生方面發(fā)揮著重要作用，若其缺乏則有可能導(dǎo)致嚴(yán)重的血管畸形和缺失[12]。

共培養(yǎng)體系技術(shù)是將兩種細(xì)胞共同培養(yǎng)，其細(xì)胞可來(lái)源于不同組織，也可來(lái)源于同一組織，組織工程化尿道成功與否取決于新生組織血供情況，而血管內(nèi)皮細(xì)胞在這個(gè)過(guò)程中所起的作用比較關(guān)鍵。Peichev等[13]將間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSC)和內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)后觀察，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)的高低程度與內(nèi)皮細(xì)胞之間有著緊密的聯(lián)系，與之接觸的內(nèi)皮細(xì)胞能促進(jìn)其增加。脂肪干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)首先在組織工程骨的研究中取得一定成功，并且積累了一定的經(jīng)驗(yàn)。研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)除了使血管化速度提高之外，還能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化、增殖[14]。

尿道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞作為一種成熟細(xì)胞，二者的再生能力均欠佳，所以一旦出現(xiàn)缺失的情況，尿道自身很難再自行修復(fù)[15]。本研究中，我們將脂肪干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞采用接觸式共培養(yǎng)方式進(jìn)行培養(yǎng)，7 d時(shí)觀察部分細(xì)胞仍保留原有的梭形，另外一部分細(xì)胞形態(tài)可呈多角形、巢樣分布，14 d時(shí)觀察細(xì)胞間可見(jiàn)許多相互連接的突觸，部分細(xì)胞可融合成團(tuán)塊狀。術(shù)后4周時(shí)對(duì)經(jīng)過(guò)修復(fù)的尿道行組織學(xué)檢查，鏡下可見(jiàn)2～3層上皮細(xì)胞紊亂地排列在基質(zhì)表面，平滑肌組織可見(jiàn)位于上皮細(xì)胞下。術(shù)后8周時(shí)可見(jiàn)明顯增多的上皮細(xì)胞層均勻排列在基質(zhì)表面，黏膜上皮下可見(jiàn)增多的新生小血管、平滑肌及纖維組織。免疫組化結(jié)果顯示共培養(yǎng)細(xì)胞組在新生小血管和平滑肌細(xì)胞再生方面與對(duì)照組相比有著明顯的優(yōu)勢(shì)，并且術(shù)后重建尿道組織血管化及上皮化程度、血管數(shù)目及平滑肌數(shù)逐漸增多并且逐漸規(guī)則化，形成的尿道組織與正常尿道組織比較接近。此外，共培養(yǎng)細(xì)胞組新生的血管數(shù)目較單純脂肪干細(xì)胞組和血管內(nèi)皮細(xì)胞組增多。術(shù)后排尿結(jié)果提示共培養(yǎng)組的術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率明顯低于單純支架組和單一細(xì)胞復(fù)合支架組。本研究說(shuō)明應(yīng)用脂肪干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞體外共培養(yǎng)聯(lián)合脫細(xì)胞基質(zhì)材料構(gòu)建組織工程尿道是可行的。

目前共培養(yǎng)細(xì)胞的研究已取得了一定的成就，并且有著廣泛的應(yīng)用前景。但是，共培養(yǎng)細(xì)胞之間相關(guān)作用的機(jī)制以及種植到機(jī)體后細(xì)胞的存活遷移情況尚未清楚。相信經(jīng)過(guò)科研工作者的不懈努力，細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)將會(huì)日趨成熟完善，其在組織工程中的應(yīng)用將會(huì)更加廣泛。