趙丹丹，張恩風(fēng)，莫丹，白麗娟，張玉貞，邊賀東

(廣西民族大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院 廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530006)

酞菁中心位置的空腔內(nèi)有四個(gè)氮原子，容易和金屬元素發(fā)生配位作用，形成具有特殊顏色的配合物，俗稱金屬酞菁[1]。酞菁分子中含有18π電子，因其特殊的結(jié)構(gòu)，具有良好的穩(wěn)定性[2]。由于金屬酞菁在有機(jī)溶劑和水中的溶解性較小，研究者發(fā)現(xiàn)在酞菁環(huán)上引入取代基，如 —COOH、—SO3H等均能有效增強(qiáng)酞菁在水中的溶解度[3]。

血清白蛋白是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，易和藥物分子以分子間力相結(jié)合，常作為載體來(lái)研究[4]。通過(guò)苯酐-尿素法合成了八羧基酞菁錳(MnOCPc)和八羧基酞菁鐵(FeOCPc)。在模擬人體生理?xiàng)l件下，使用熒光光譜、紫外-可見(jiàn)吸收光譜、圓二色光譜等方法，研究了MnOCPc、FeOCPc與BSA 的相互作用。研究了金屬酞菁及金屬酞菁-BSA雜化蛋白SOD活性[5]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

均苯四甲酸酐、尿素、鉬酸銨、牛血清白蛋白(BSA，分子量為66 210)、氯化鐵、氯化錳、黃嘌呤氧化酶(XOD)、黃嘌呤(XO)、氯化硝基四氮唑蘭(NBT)、超氧化物歧化酶(SOD)、氯化鈉、乙醇、磷酸鹽等均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水。

Perkkin Elmer instruments Spectrum One紅外分光光度計(jì)；RF-5301 型熒光分光光度計(jì)；Jasco-810圓二色譜儀；HX-HH420A4超級(jí)恒溫水浴箱；Cary100紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；arium Pro 超純水系統(tǒng)。

1.2 溶液配制

配制濃度為 0.05 mol/L，pH=7.43的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)，其中含有NaCl的濃度為0.1 mol/L；以PBS緩沖溶液配制牛血清白蛋白儲(chǔ)存液(1.0×10-3mol/L)，并保存于4 ℃，用前稀釋。實(shí)驗(yàn)中NaCl的濃度均保持在0.1 mol/L，用以維持離子強(qiáng)度。

1.3 金屬酞菁的合成

八羧基酞菁錳(MnOCPc)和八羧基酞菁鐵(FeOCPc)的制備參照文獻(xiàn)[6]，所得產(chǎn)率分別為18%和20%。

1.4 金屬酞菁與BSA相互作用

1.4.1 紫外-可見(jiàn)吸收光譜的測(cè)定 在3 mL 濃度為1×10-6mol/L的BSA溶液的石英比色皿中，用移液槍向BSA溶液中滴加金屬酞菁儲(chǔ)備液，使金屬酞菁配合物濃度與BSA溶液濃度比為0～3，溫度為298 K時(shí)，分別掃描純BSA和金屬酞菁配合物與BSA作用的紫外-可見(jiàn)光譜曲線。

1.4.2 穩(wěn)態(tài)熒光光譜的測(cè)定 在3 mL 濃度為1×10-6mol/L的BSA溶液加入石英比色皿中，固定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，狹縫寬度均為15 nm，用移液槍每次加入3 μL 濃度為1×10-3mol/L的MnOCPc或FeOCPc儲(chǔ)備液。使金屬配合物濃度與BSA溶液濃度比為0～10，每次加完樣品，攪拌均勻，靜止3 min。在溫度297 K，掃描300～450 nm純BSA的熒光光譜曲線和金屬酞菁與BSA作用的淬滅曲線。

1.4.3 圓二色光譜的測(cè)定 將3 mL 濃度為1×10-6mol/L的BSA溶液于石英比色皿中，用移液槍每次加入3 μL濃度為1×10-3mol/L的MnOCPc或FeOCPc儲(chǔ)備液，使金屬酞菁與BSA溶液濃度比為0～2。掃描190～280 nm范圍BSA的圓二色光譜曲線和金屬酞菁與BSA作用的圓二色光譜曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物的光譜分析

2.1.1 元素分析 MnOCPc元素分析結(jié)果為：理論值(%)：C，52.25；H，1.75；N，12.19；計(jì)算值(%)：C，52.07；H，1.79；N，12.08。

FeOCPc元素分析結(jié)果為：理論值(%)：C，52.20；H，1.75；N，12.19；計(jì)算值(%)：C，52.14；H，1.93；N，12.12。

2.1.2 紫外光譜 將MnOCPc、FeOCPc分別溶于二甲基亞砜(DMSO)，配制成1×10-6mol/L的溶液，設(shè)置波長(zhǎng)范圍為200～800 nm進(jìn)行掃描，MnOCPc、FeOCPc有兩個(gè)強(qiáng)吸收區(qū)域，在600～700 nm的Q帶的吸收峰為680 nm，在300～400 nm的B帶吸收峰為343 nm，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。證明了該產(chǎn)物為金屬酞菁配合物[7]。

2.2 金屬酞菁配合物與牛血清白蛋白相互作用

2.2.1 金屬酞菁配合物與BSA相互作用的紫外-可見(jiàn)吸收光譜 在BSA的分子中，紫外光譜的280 nm波長(zhǎng)處有一個(gè)由芳香族氨基酸(Trp、Tyr和Phe)造成的吸收峰。該吸收峰用于研究BSA和化合物之間的相互作用。由圖1可知，在保持BSA濃度不變的情況下，逐漸滴加MnOCPc和FeOCPc溶液，BSA的紫外-可見(jiàn)光譜顯示在203 nm和280 nm處的吸收峰逐漸降低且同時(shí)伴隨著稍稍的紅移[10]，說(shuō)明金屬酞菁與BSA進(jìn)行了結(jié)合作用。圖中從a到d，配合物的濃度依次為0，1，2，3×10-6mol/L，BSA的濃度為1.0×10-6mol/L。

圖1 金屬酞菁配合物與BSA相互作用的紫外吸收光譜

2.2.2 金屬酞菁配合物與BSA相互作用的熒光光譜 BSA分子中含有能產(chǎn)生熒光的殘基(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm或者335 nm時(shí)，BSA分子中色氨酸殘基會(huì)產(chǎn)生比較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰[11]。由圖2可知，在298 K溫度下，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，BSA在341 nm左右附近有比較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，在保持BSA的濃度不變的條件下，隨著所加入的金屬酞菁配合物濃度的增大，熒光發(fā)射峰的峰形基本保持不變，峰的強(qiáng)度逐漸降低，表明BSA與金屬酞菁配合物之間發(fā)生了相互作用，從而引起了熒光淬滅[12]。圖2的條件為：溫度為298 K，λex= 280 nm，λem= 341 nm，pH=7.43，BSA的濃度為1.0×10-6mol/L，從a到k，配合物的濃度為0～2×10-5mol/L，每一濃度差為2×10-6mol/L，其底線是酞菁溶液最大濃度的熒光曲線。

圖2 298 K溫度下金屬酞菁配合物對(duì)BSA的熒光猝滅光譜

2.2.3 金屬酞菁配合物對(duì)BSA熒光淬滅機(jī)理 根據(jù)熒光猝滅過(guò)程的作用機(jī)制的不同，通?？梢苑譃殪o態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅。前者歸因于熒光團(tuán)和猝滅劑形成基態(tài)復(fù)合物，后者是由熒光團(tuán)和猝滅劑相互碰撞引起的[13]。

熒光猝滅的過(guò)程可以利用Stern-Volmer方程來(lái)進(jìn)行分析：

F0/F=1+kqτ0[Q]=1+KSV[Q]

(1)

其中，F(xiàn)0是沒(méi)有加金屬酞菁配合物時(shí)BSA的熒光強(qiáng)度；F則是加入了金屬酞菁配合物后的BSA的熒光強(qiáng)度；kq是猝滅速率常數(shù)；τ0是無(wú)金屬酞菁配合物時(shí)BSA的平均熒光壽命(約為10-8s)；[Q]是金屬酞菁配合物的濃度；KSV是Stern-Volmer猝滅常數(shù)。

根據(jù)式(1)，以[Q]為橫坐標(biāo)，F(xiàn)0/F為縱坐標(biāo)作圖，可以分別得到298 K溫度下MnOCPc或FeOCPC與BSA作用的Stern-Volmer曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3和表1。

圖3 金屬酞菁配合物與BSA相互作用的Stern-Volmer曲線圖

由表1可知，金屬酞菁與蛋白質(zhì)相互作用的猝滅速率常數(shù)kq均大于動(dòng)態(tài)猝滅的最大猝滅速率常數(shù)2.0×1010L/(mol·s)，說(shuō)明BSA與金屬酞菁相互作用為靜態(tài)猝滅過(guò)程。

表1 金屬酞菁配合物與BSA相互作用的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)和位點(diǎn)數(shù)

2.2.4 金屬酞菁配合物與BSA的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù) 對(duì)靜態(tài)猝滅過(guò)程來(lái)說(shuō)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n和結(jié)合常數(shù)K可以通過(guò)式(2)來(lái)計(jì)算[14]：

lg[(F0-F)/F]=lgK+nlg[Q]

(2)

根據(jù)公式(2)，以lg[Q]為橫坐標(biāo)， lg[(F0-F)/F]為縱坐標(biāo)作圖(圖4)。根據(jù)直線的截距和斜率可以計(jì)算出結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n和結(jié)合常數(shù)K。

圖4 配合物與BSA相互作用的雙對(duì)數(shù)曲線圖

由圖4可知，金屬酞菁與BSA作用的結(jié)合常數(shù)都大于104L/mol，而且計(jì)算所得結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n都近似等于1(表1)，說(shuō)明MnOCPc及FeOCPc與BSA相互作用的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)都為1。

2.2.5 金屬酞菁配合物與BSA相互作用的圓二色譜 在298 K時(shí)，BSA的濃度為1.0×10-6mol/L，從a到c，[BSA]∶[complex]=1∶0，1∶1和1∶2，見(jiàn)圖5。

由圖5可知，隨著加入的MnOCPc、FeOCPc配合物濃度的增加，牛血清白蛋白的峰形保持不變，吸收峰的位置稍微向上移動(dòng)，說(shuō)明加入MnOCPc、FeOCPc與肽鍵發(fā)生了相互作用，表明配合物能夠誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的α-螺旋含量降低，導(dǎo)致BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

圖5 金屬酞菁配合物與BSA相互作用的圓二色光譜

可以通過(guò)式(3)計(jì)算蛋白質(zhì)分子中摩爾橢圓率(MRE)[15]：

MRE=θobs(m deg)/(10×n×l×Cp)

(3)

其中，θobs為橢圓度(所求MRE對(duì)應(yīng)CD圖上的縱坐標(biāo))，Cp為BSA的摩爾濃度(1.0×10-6mol/L)，n為氨基酸殘基的數(shù)目(BSA為583)，l為樣品池的厚度(1 cm)。

BSA的α-螺旋含量的定量分析可以使用以下等式獲得[16]：

(4)

通過(guò)計(jì)算可以得出，純蛋白(BSA)α-helix結(jié)構(gòu)含量為63.99%，當(dāng)BSA-FeOCPC、BSA-MnOCPc體系均為1∶1時(shí)，BSA的α-helix結(jié)構(gòu)分別為58.8%，60.78%，說(shuō)明BSA的α-helix結(jié)構(gòu)含量降低，當(dāng)BSA-FeOCPC、BSA-MnOCPc體系為2∶1時(shí)，BSA的α-helix結(jié)構(gòu)分別為55.31%，57.61%，BSA α-helix的含量繼續(xù)降低，但是仍以BSA中α-helix為主，此結(jié)果說(shuō)明BSA分別與MnOCPc、FeOCPc結(jié)合引起的BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致了BSA中的α-helix結(jié)構(gòu)百分含量減少，相對(duì)來(lái)說(shuō)，F(xiàn)eOCPc的加入對(duì)BSA 的α-helix結(jié)構(gòu)影響相對(duì)較大。

2.3 金屬酞菁的SOD活性

為了進(jìn)一步確定MnOCPc、FeOCPc和MnOCPc-BSA、FeOCPc-BSA的SOD活性，通過(guò)式(5)作進(jìn)一步計(jì)算來(lái)獲得其反應(yīng)速率常數(shù)[18]：

(5)

金屬酞菁配合物或金屬酞菁配合物-BSA加合物的濃度為橫坐標(biāo)，以V0/Vcat-1為縱坐標(biāo)作圖，V0是NBT的還原速率，Vcat是復(fù)合物存在時(shí)NBT的還原速率，得到圖6中的曲線。

圖6 配合物[Complex]的V0/Vcat-1曲線圖

由圖6可知，MnOCPc與MnOCPc-BSA相比斜率幾乎沒(méi)有變化，說(shuō)明加了BSA并沒(méi)有明顯提高其SOD活性。相對(duì)來(lái)說(shuō)，F(xiàn)eOCPc-BSA與FeOCPc相比斜率明顯的降低，說(shuō)明在錳金屬酞菁配合物中加入了BSA 提高了SOD活性。

為了更進(jìn)一步研究FeOCPc、MnOCPc、FeOCPc-BSA、MnOCPc-BSA的SOD活性，計(jì)算了其IC50值[19]。參照式(6)可求IC50值。

ΔA0/ΔAcomplex-1=1

(6)

其中，ΔA0是添加FeOCPc、MnOCPc或其加合物之前在550 nm處吸光度的差值；ΔAcomplex是添加FeOCPc、MnOCPc或其加合物之后在550 nm處吸光度的差值；此時(shí)若以ΔA0/ΔAcomplex-1為橫坐標(biāo)，金屬酞菁配合物或其BSA加合物的濃度為縱坐標(biāo)作圖，可以得到一條直線。再參考公式(7)，即可以求出IC50值，通過(guò)IC50可以進(jìn)一步求出Kcat[20]。

Kcat=Kdetector[detector]/ IC50

(7)

同時(shí)測(cè)定了天然SOD酶的活性，求得其IC50值為1.56×10-6mol/L，根據(jù)式(7)，得到表觀速率常數(shù)值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 金屬酞菁配合物及加合物的IC50和Kcat值

由表2可知，在沒(méi)有加牛血清白蛋白之前，這兩種金屬酞菁配合物的SOD活性順序?yàn)镸nOCPc>FeOCPc，而加入BSA以后，SOD活性順序?yàn)椋篎eOCPc-BSA>MnOCPc-BSA>MnOCPc>FeOCPc。FeOCPc的 IC50值大于相應(yīng)的FeOCPc-BSA加合物的值，在加了BSA后，其表觀速率常數(shù)也由原來(lái)的4.47×103M-1·s-1提高到14.95×103M-1·s-1，增加了2倍之多；說(shuō)明牛血清白蛋白的加入增強(qiáng)了金屬酞菁配合物的SOD活性。這可能歸因于金屬酞菁配合物與BSA結(jié)合后，BSA為其提供了疏水性空腔，BSA中某些帶電荷的殘基基團(tuán)促進(jìn)了自由基的活化，使反應(yīng)更容易發(fā)生。相較而言MnOCPc加了BSA后，其IC50和Kcat幾乎沒(méi)有提高。說(shuō)明BSA對(duì)不同金屬中心的配合物促進(jìn)的效果不同，原因可能與金屬離子自身的性質(zhì)有關(guān)，也可能與金屬酞菁分子的屬性有關(guān)。

3 結(jié)論

通過(guò)熔融法使均苯四甲酸酐、尿素與氯化錳反應(yīng)，得到八羧基金屬酞菁錳和金屬酞菁鐵。通過(guò)熒光光譜、紫外光譜、圓二色光譜等分析方法研究了金屬酞菁配合物與BSA的相互作用。熒光光譜表明，隨著金屬酞菁配合物濃度的增加，BSA有規(guī)律的發(fā)生了熒光猝滅現(xiàn)象，說(shuō)明金屬酞菁錳和金屬酞菁鐵的加入可以使得BSA內(nèi)源性熒光猝滅，主要為靜態(tài)猝滅。通過(guò)Stern-Volmer方程得到了淬滅常數(shù)KSV分別為5.2×104，6.9×104L/mol，結(jié)合位點(diǎn)為1。紫外光譜表明，隨著金屬酞菁配合物濃度的增加，BSA在203，280 nm的吸光度逐漸降低，并伴有紅移。圓二色光譜表明，金屬酞菁配合物使BSA 的構(gòu)象發(fā)生變化，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低。金屬酞菁、金屬酞菁-BSA加合物的抗氧化活性測(cè)試表明均表現(xiàn)出一定的SOD活性，說(shuō)明牛血清白蛋白的加入增強(qiáng)了金屬酞菁配合物的SOD活性。