李少華 朱 娟 康 碩 段豫磊 史建紅 高文山△ 董曉東#

（河北大學(xué)，1 附屬醫(yī)院新生兒科，2 醫(yī)學(xué)院，保定 071000）

截至到2015年，我國(guó)60 周歲以上人口約占總?cè)丝诘?7.9%[1]，而骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）是與衰老密切相關(guān)的骨骼疾病[2]。目前，常見(jiàn)的雄性骨質(zhì)疏松模型動(dòng)物為激素誘發(fā)的去勢(shì)（去睪丸）骨質(zhì)疏松模型大鼠，但存在機(jī)體損傷大、并發(fā)癥多等缺點(diǎn)[3]。中醫(yī)理論認(rèn)為，房勞是“腎精虧虛”的重要誘因，而“腎精虧虛”是促進(jìn)衰老并伴隨骨質(zhì)疏松癥的主要發(fā)病機(jī)制。本研究依據(jù)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“腎主骨生髓”理論，采用“房勞”的方法建立“腎精虧虛”模型動(dòng)物，探討“腎精虧虛”對(duì)骨質(zhì)的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30 只SPF 級(jí)Wistar 雄性大鼠（250～300 g；河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買，動(dòng)物倫理許可證號(hào)：IACUC-2018018），適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，控制溫度22.0℃±0.2℃，自由進(jìn)食。

1.2 主要試劑

蘇木精-伊紅染液、戊巴比妥鈉溶液（50 mg/kg）（索萊寶公司）；多聚甲醛、乙二胺四乙酸（科密歐公司）；p16抗體（1∶100，Abcam公司）；1型前膠原氨基端延長(zhǎng)肽（N.terminal propeptide of type I collagen，P1NP）與1型膠原C末端肽（cross linked C-telopeptide of type I collagen，CTX-1）檢測(cè)試劑盒（睿信生物科技公司）。

1.3 “腎精虧虛”模型雄性大鼠的建立

Wistar 雄性大鼠（250～300 g）適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，用計(jì)算機(jī)隨機(jī)數(shù)法分為正常組、模型組以及自然衰老組，每組10 只。其中模型組采用“房勞”的復(fù)合傷腎法復(fù)制“腎精虧虛”模型動(dòng)物。

采用電針療儀（華佗牌，SDZ-Ⅱ）自制成電刺激儀，用電針刺激雄性大鼠的大腿內(nèi)側(cè)性相對(duì)敏感區(qū)（選用連續(xù)波輸出模式，輸出脈沖頻率 40 Hz，輸出電流2 mA）刺激生殖股神經(jīng)的股區(qū)[4]，引起大腿內(nèi)側(cè)部皮膚神經(jīng)興奮，使精囊、提睪肌收縮，使其陰莖逐漸勃起并射精，達(dá)到人工耗傷生殖之精的目的。由于大鼠一般是在夜間進(jìn)行交配，所以刺激時(shí)間選擇在晚上20：00，持續(xù)7 d，間隔3 d，3 個(gè)循環(huán)，共30 d。

1.4 ELISA 檢測(cè)血清中P1NP 和CTX-1 水平

按 ELISA 試劑盒說(shuō)明書操作流程檢測(cè)血清中P1NP 和CTX-1 水平。

1.5 骨密度測(cè)量

取材前1 周將各組大鼠用戊巴比妥鈉溶液麻醉后，采用Prodigy Advance 型雙能X 射線骨密度分析儀系統(tǒng)對(duì)大鼠的全身進(jìn)行骨密度測(cè)定。

1.6 取材

正常組及模型組于12月齡時(shí)取材，自然衰老對(duì)照組大鼠于16月齡時(shí)取材。按照大鼠與人類壽命換算，12月齡與16月齡大鼠相當(dāng)于人類40 歲中年期以及60 歲老年期[5]。各組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液，待大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，內(nèi)眥取血，離心分離血清；并取出雙側(cè)脛骨，分離肌肉筋膜，立即投入4%多聚甲醛固定液中，4℃固定48 h。

1.7 骨組織石蠟切片制備

按照文獻(xiàn)制備骨組織石蠟切片[6]。脛骨從4%多聚甲醛固定液中取出，PBS 緩沖液沖洗3 次，置于10%乙二胺四乙酸（EDTA）（pH7.0，4℃）中脫鈣14 d，用大頭針可無(wú)阻力刺穿骨組織時(shí)即為脫鈣成功，取干骺端進(jìn)行石蠟包埋。半自動(dòng)切片機(jī)（RM2135，Leica）進(jìn)行4 μm 厚的骨縱向 切片。

1.8 H-E 染色和p16 蛋白免疫熒光化學(xué)染色

對(duì)骨切片脫蠟水化后，進(jìn)行H-E 染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察骨組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)；免疫熒光化學(xué)染色后，熒光顯微鏡下觀察p16 蛋白表達(dá)情況，并利用Image J 軟件進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，均數(shù)比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），若方差齊，兩兩比較采用最小顯著差異（least significant difference，LSD）t檢驗(yàn)；若方差不齊，則采用Dunnett-t檢驗(yàn)，進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 造模后大鼠的變化情況

造模后，模型組大鼠出現(xiàn)毛色暗淡無(wú)光澤，精神萎糜不振，體質(zhì)量稍有減輕并增長(zhǎng)緩慢，反應(yīng)遲鈍等明顯的“腎精虧虛”表現(xiàn)。

2.2 血清P1NP 與CTX-1 水平比較

ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組（0.503± 0.004）比較，模型組（0.557±0.002）和自然衰老組（0.537±0.012）大鼠血清CTX-1 含量顯著升高（P＜0.05），模型組（0.557±0.002）與自然衰老組（0.537±0.012）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；正常組血清P1NP 水平為0.430±0.032，模型組為0.461±0.012，自然衰老組為0.458±0.042，3 組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 骨密度比較

與正常組（11.23±2.23）比較，模型組（8.94±1.78）與自然衰老組（10.04±1.84）大鼠全身BMD 顯著降低（P＜0.05），模型組與自然衰老組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1）。

2.4 骨小梁分布比較

H-E 染色顯示，正常組大鼠脛骨干骺端骨小梁分布均勻，排列密集，呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，骨小梁粗細(xì)、間距有序。模型組和自然衰老組大鼠骨小梁明顯稀疏，間距增寬，粗細(xì)不均且出現(xiàn)斷裂（圖2）。

2.5 p16 蛋白表達(dá)比較

免疫熒光化學(xué)染色顯示，p16 蛋白定位于細(xì)胞核呈紅色熒光，核DAPI 呈藍(lán)色。模型組（82.97±1.95）和自然衰老組（85.56±2.07）大鼠骨組織中p16 蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比明顯高于正常組（21.19±2.48），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型組與自然衰老組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖3）。

圖1 各組骨密度比較。A：正常組；B：模型組；C：自然衰老組.Fig1 Comparison of bone mineral density in each group.A：Normal group; B：Model group; C：Aging group.

圖2 各組骨小梁分布比較，×400。A：正常組；B：模型組；C：自然衰老組.Fig2 Comparison of bone trabeculae distribution in each group，× 400.A：Normal group; B：Model group; C：Aging group.

圖3 各組p16 蛋白表達(dá)比較，×400。A1～A3：正常組; B1～B3：模型組; C1～C3：自然衰老組；1：p16 蛋白表達(dá)；2：DAPI 復(fù)染；3：合并.Fig3 Comparison of p16 protein expression in each group，×400.A1-A3：Normal group; B1-B3：Model group; C1-C3：Aging group；1：p16 protein expression；2：DAPI；3：Merge.

3 討論

依據(jù)“腎藏精”中醫(yī)理論：腎為先天之本，“腎主骨生髓，腎主生殖”立論[7]，故“腎精虧虛”可影響骨骼發(fā)育和生殖功能[8]，而腎精盛衰與年齡有關(guān)，腎精在青壯年階段較為充盛，而后隨著年齡的增長(zhǎng)，腎精逐漸耗竭，終致衰老。因此，腎精虧虛證常見(jiàn)于中老年階段[9]。中醫(yī)理論認(rèn)為：節(jié)欲養(yǎng)生者，年雖老而能積精全神；縱欲耗真者，年雖少而精薄神虛[10]。房事由腎所主，房勞太過(guò)可傷腎之陰、陽(yáng)，房勞所傷當(dāng)以伐傷腎精為主，此即《素問(wèn)上古天真論》“以欲竭其精”之意，故本實(shí)驗(yàn)采用房勞方法建立“腎精虧虛”模型動(dòng)物。有研究表明，采用房勞方法建立此模型后，雄鼠子代生育力損傷[18]，精子密度和活動(dòng)力下降，并且表現(xiàn)出與此研究中出現(xiàn)類似的腎精虧虛表現(xiàn)。比起傳統(tǒng)的自然衰老模型，這種造模方法節(jié)約飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)成本，操作簡(jiǎn)單，時(shí)間周期較短，此模型易于復(fù)制。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中p16 是衰老標(biāo)志物之一[11-13]。本研究結(jié)果可見(jiàn)模型組和自然衰老組大鼠骨組織中p16陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于正常組，提示腎精虧虛可促進(jìn)大鼠骨組織衰老。

骨骼在整個(gè)生命過(guò)程中通過(guò)骨吸收和骨形成的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，使骨骼不斷重塑[14]，當(dāng)兩者的動(dòng)態(tài)平衡被破壞將造成骨質(zhì)疏松。人的骨量在30 歲時(shí)達(dá)到峰值，而后骨質(zhì)量逐漸降低[15]。隨著年齡的增加，骨吸收超過(guò)骨形成，骨吸收逐漸增多，骨形成速度減緩。P1NP 是骨形成標(biāo)記物，CTX-1 是骨吸收標(biāo)記物[16]。已知老年性骨質(zhì)疏松癥是Ⅱ型原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，主要特征是骨密度下降、骨小梁間隙變大、血清CTX-1 含量增多以及P1NP 含量不會(huì)出現(xiàn)明顯變化[17]。本研究結(jié)果同時(shí)可見(jiàn)，與正常組比較，模型組和自然衰老組大鼠骨密度明顯降低，骨小梁粗細(xì)不均、稀疏而斷裂，提示“腎精虧虛”與骨質(zhì)疏松密切相關(guān)。綜上所述，“腎精虧虛”可促進(jìn)雄性大鼠骨質(zhì)疏松。