（中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農業(yè)農村部奶及奶制品質量安全控制重點實驗室/農業(yè)農村部奶產品質量安全風險評估實驗室（北京）/農業(yè)農村部奶及奶制品質量監(jiān)督檢驗測試中心（北京），北京 100193）

硫氰酸鈉是一種易溶于水的白色斜方系結晶或粉末，在水中溶解產生硫氰酸根離子（SCN-）和鈉離子（Na+）。因其具有保鮮防腐的功能，在上個世紀80年代，硫氰酸鈉作為一種食品添加劑，被普遍應用于乳制品行業(yè)。硫氰酸鈉的保鮮作用，主要是通過硫氰酸根與乳過氧化物酶作用，阻礙細菌的正常代謝途徑，從而達到抑制細菌的作用[1]。由于受到當時冷鏈運輸技術不發(fā)達及運輸成本高、乳制品企業(yè)路途較遠等因素的限制，生乳在收購和運輸過程中很容易發(fā)生酸敗變質?？紤]到成本低廉、易添加等因素，很多人通過聯(lián)用過氧化氫和硫氰酸鈉來對牛乳進行保鮮，這大大地促進了硫氰酸鈉在乳制品行業(yè)，尤其是生乳收購過程中的使用率，進而成為遺留至今的問題。2008年12月衛(wèi)生部發(fā)布的第一批“違禁及濫用食品添加劑品種名單”中明確規(guī)定乳及乳制品中硫氰酸鈉屬違法添加物質[2]。

硫氰酸根是典型的類鹵素，帶負電荷，直線型，多電子離子，與其他原子有較強的絡合性。大多數(shù)文獻資料中報道硫氰酸鈉的測定分析方法有可見分光光度法[3,4]、氣相色譜法[5]、氣相質譜聯(lián)用法[6]、液相色譜法[7-8]、離子色譜法[9～12]和試劑盒法[13]。其中，分光光度法操作簡便、成本低廉，但存在顯色不穩(wěn)定、靈敏度低、重現(xiàn)性差的缺點，氣相色譜法需要衍生，且污染環(huán)境[1]。試劑盒法檢出限過高，無法精確定量。離子色譜法具有精密度高、選擇性好和操作簡便的特點，可同時實現(xiàn)多組分陰離子分離[14]。

離子色譜分離技術是繼液相色譜、氣相色譜后的第三大色譜分離技術，主要應用于無機離子的分離和測定[15]。在食品、添加劑、醫(yī)藥、環(huán)境、地質各領域都得到了廣泛的拓展和應用[16～19]，并成為該領域檢測的標準分析方法。離子色譜法通過采用離子交換的原理，用低交換容量的新型離子交換分離柱分離樣品離子，并在分離柱后串接一根高交換容量的特制抑制柱，通過化學反應把具有高電導的淋洗液轉換成低電導的淋洗液，促使電導檢測器能靈敏、方便地檢測出被分離的離子[20]。離子交換色譜適用于易于極化且疏水性強的無機、有機陰離子和陽離子的分離。其分離過程主要是在電場力的作用下，流動相中所帶離子和固定相上的親和離子相互交換的過程，陰離子分離的交換樹脂為季胺基的交換樹脂。本研究采用離子色譜法，對淋洗液、色譜柱、選擇性、前處理條件、線性范圍、方法檢出限與定量限、實驗室內加標回收率與精密度、實驗室間加標回收率與精密度、標準溶液保存穩(wěn)定性、生乳樣品保存穩(wěn)定性與制備等方面進行了系統(tǒng)優(yōu)化和考察。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈，色譜純，F(xiàn)isher；硫氰酸鈉（NaSCN，CAS：540-72-7），純度≥99.99%，SIGMA；微孔過濾器，0.22μ m，安普；RP柱，1.0mL，Thermo。

1.2 儀器與設備

離子色譜儀，配電導檢測器，戴安公司；高速冷凍離心機，8 000r/min，4℃，日立；分析天平，感量0.1mg、0.01g，賽多利斯；渦旋混勻器，IKA；烘箱，80℃±5℃，MEMMERT；超純水機，MILLIPORE。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

表1 離子色譜儀淋洗液梯度淋洗條件

色譜柱：氫氧化物選擇性、疏水性低且可兼容梯度洗脫的高容量陰離子交換柱，Dionex IonPac AS16型色譜柱（4mm×250mm）和Dionex IonPac AG16型保護柱（4mm×50mm）；抑制器：Dionex ASRS-300 4mm陰離子抑制器，外加水抑制模式，抑制器電流為112～149mA，外加水流量1.2mL/min；淋洗液：氫氧化鉀溶液，梯度淋洗，流速為1.0mL/min。色譜淋洗液梯度淋洗條件參見表1。進樣體積：100μL；柱溫：30.0℃；電導池溫度：35.0℃。

1.3.2 標準溶液的制備

硫氰酸根標準儲備液（1000mg/L）：將硫氰酸鈉于80℃烘箱內烘干2h，準確稱取干燥后的硫氰酸鈉0.1397g，用水定容至100mL，混勻。0～4℃保存，有效期為6個月。

硫氰酸根標準中間液（10mg/L）：準確吸取1.00mL硫氰酸根標準儲備液，用水定容至100mL，混勻。0～4℃保存，有效期為1個月。

硫氰酸根標準工作液：分別吸取硫氰酸根標準中間液0、10、20、50、100、500和1 000μL，用水定容至10mL，混勻，得到濃度分別為0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.50和1.00 mg/L的硫氰酸根標準工作液。0～4℃保存，有效期為1個月。

1.3.3 樣品處理

將樣品充分恢復至室溫，稱取4.00g（精確至0.01g）樣品，用乙腈定容至10mL，渦旋混勻1min，靜置20min，置于離心機上以8 000r/min、4℃離心5min。離心后，準確移取1.00mL上清液用水定容至10mL，混勻。取上述溶液依次過0.22μm過濾器、RP柱，棄去前3mL濾液，收集后面的濾液。將收集的樣品測試溶液和配制好的標準工作液同時置于離子色譜儀上，按儀器色譜分析條件進行測定。用硫氰酸根標準品的保留時間定性，峰面積定量，同時做空白試驗。

1.3.4 結果計算

試樣中硫氰酸根的含量以質量濃度X計，數(shù)值以毫克每千克（mg/kg）表示，按下式計算：

式中：c為待測溶液從標曲上查得硫氰酸根的濃度（mg/L）；V1為樣品用乙腈提取時定容體積（mL）；V2為移取離心后上清液的體積（mL）；V3為上清液稀釋定容的體積（mL）；m為試樣質量（g）。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的選擇

SCN-是疏水性和易極化的陰離子。采用可兼容梯度洗脫的高容量陰離子分離柱——Ion Pac AS 16型分析柱(4mm×250mm)，適用于易極化陰離子的分析，通過在固定相上鍵合強親水性烷醇基季銨鹽，增強對OH-的親和力，使用中等濃度的OH-淋洗液，即可以快速分離易極化陰離子，而且峰型對稱、尖銳。

2.2 淋洗液的選擇

本研究選取KOH溶液作為淋洗液，淋洗液OH-由淋洗液自動發(fā)生器在線產生，只加水，不用化學試劑，操作簡便，同時ASRS型抑制器可有效降低背景電導和提高分析物測定靈敏度。OH-作為淋洗液抑制反應產物是水，背景電導較小，通常小于2μS；同時可采用梯度淋洗，且運行梯度時基線較穩(wěn)，水負峰小，可大體積進樣。經優(yōu)化，淋洗液為45mmol/L KOH，可在12min內完成硫氰酸根的洗脫出峰，且前后無明顯干擾峰。

2.3 選擇性試驗

由于牛奶樣品在前處理過程中經過乙腈沉淀蛋白、RP柱除去了疏水性有機物，因此樣品溶液基質中可能對SCN-檢測有干擾的是共存的陰離子，因此需要考察所選擇的色譜柱與淋洗液是否能將SCN-與共存離子有效分離。本研究將F-、Br-、NO3-、NO2-、SO42-、PO43-這幾種常見陰離子添加到SCN-標準溶液中進行分離分析，實驗采用濃度45mmol/L氫氧化鉀溶液作為淋洗液，1.0mL/min的流速進行分離，SCN-與其他可能共存的陰離子得到了較好的分離，共存離子對SCN-檢測無干擾。7種陰離子色譜圖見圖1。

圖1 硫氰酸根離子與6種常見陰離子混合標準溶液的離子色譜圖

2.4 樣品前處理條件優(yōu)化

牛奶中含有大量的蛋白質和脂肪，因此提取過程中去除蛋白和脂肪是首要考慮的問題。蛋白去除不好，提取液很難用針頭濾膜微孔過濾器過濾，且過濾后大分子雜質很多，這些成分與分離柱的填料發(fā)生作用，影響柱效和色譜柱的使用壽命。通過查閱文獻結合實驗經驗，本研究選取乙腈作為提取劑，乙腈的蛋白沉降作用較好，提取液靜置離心后澄清度好，易于后續(xù)過濾膜及過固相萃取柱的操作。由于前處理過程引入有機溶劑乙腈，而目前通常采用的自動循環(huán)抑制模式是利用廢液作再生液，乙腈電解成離子形態(tài)進入淋洗液通道，會導致檢測分析中基質信號值升高，待測物質峰形拖尾等問題，因而實驗采用外加水模式，以避免這種現(xiàn)象。同時，通過將乙腈提取液稀釋10倍的操作，將上機液中乙腈的含量減少至6%。另一方面，生乳中脂肪的含量也較高，而乙腈除脂肪的效果不太好，因此在離心時將溫度設定到4℃，有利于脂肪的沉降，可以很明顯地看到水、脂肪、乙腈的界面分層。

牛奶樣品基質較為復雜，乙腈提取后直接取上清液上機，樣品中雜質組分較多，隨著進樣次數(shù)增多柱效隨之下降，直接表現(xiàn)就是待測物保留時間提前，分離度下降。本研究采用OnGuard II RP柱去除污染分離柱和干擾實驗結果的有機物。RP柱是一種反相固相萃取柱，鍵合基團為含有一個微孔的二乙基苯，性能類似C18柱，主要用于去除疏水性大分子物質。取提取液1mL，用水稀釋10倍后，過OnGuard II RP柱（使用前需用5mL甲醇+10mL水進行活化），調整流速在1mL/min左右，棄去前3mL樣品流出液，收集濾液待測。經凈化處理，樣品中的脂肪、蛋白等有機殘留物被吸附在OnGuard II RP柱上，而待測分析物在OnGuard II RP柱上基本沒有保留，直接流出OnGuard II RP柱，樣品凈化效果良好。

2.5 標準溶液保存穩(wěn)定性

表2 硫氰酸根標準工作溶液在0～4℃保存穩(wěn)定性

離子色譜法檢測硫氰酸根是外標法定量，因此標準溶液濃度是否穩(wěn)定會直接影響結果。取濃度為0.01、0.02、0.05、0.10、0.50和1.00mg/L的硫氰酸根標準工作溶液，在0～4℃保存1d、30d、48d后分別測定分析，峰面積如表2所示。結果表明硫氰酸根標準工作溶液在0～4℃保存下穩(wěn)定性較好，有效期大于一個月。

2.6 方法線性范圍

配制7點不同濃度工作曲線：將硫氰酸根標準中間液（10mg/L）用水稀釋，制得標準系列工作溶液，濃度為0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L，在本法所確定的試驗條件下進樣測定，得到硫氰酸根的峰面積。以硫氰酸根的濃度x（mg/L）為橫坐標，硫氰酸根的峰面積y（μS＊min）為縱坐標，繪制標準曲線，在0.01～1.0mg/L范圍內呈良好線性關系，回歸方程y=0.7235x-0.0023，相關系數(shù)R2=0.9998，標準曲線見圖2。

圖2 硫氰酸根離子標準溶液的離子色譜圖（A）和標準曲線（B）

2.7 方法檢出限與定量限

在優(yōu)化的測定條件下，離子色譜儀對硫氰酸根的檢出限（S/N=3）為0.01mg/L，定量限（S/N=10）為0.03mg/L。在本研究過程中，組織了6家實驗室對檢出限進行驗證。驗證結果表明，6家實驗室對濃度為0.01mg/L的硫氰酸根離子標準溶液測定的信噪比均大于3（表3和圖3）?？紤]到樣品前處理過程中的稀釋倍數(shù)為25倍，本試驗在比對驗證工作中，制備了生乳中添加最低濃度點為0.25mg/kg的加標樣品，驗證結果表明信噪比均大于10，且均具有較好的回收率。因此，本方法對牛奶中硫氰酸根的檢出限為0.25mg/kg，定量限為0.75mg/kg。

圖3 硫氰酸根離子標準溶液（0.01 mg/L）的離子色譜圖（5次重復）

表3 不同實驗室對硫氰酸根離子標準溶液檢出限的驗證結果

2.8 實驗室內加標回收率和精密度

本方法的實驗室內回收率和精密度試驗，以生乳為樣品基質，添加硫氰酸根0.25mg/kg、0.50mg/kg、1.50mg/kg和5.00mg/kg，每個濃度水平進行6次重復試驗，測得硫氰酸根的回收率和精密度匯總于表4?；厥章史秶?4.6%～104.1%之間，相對標準偏差范圍在1.2%～9.2%之間。

2.9 實驗室間加標回收率和精密度

本方法分別在6家有資質的實驗室進行比對驗證實驗，以驗證其重復性與再現(xiàn)性。以生乳為樣品基質，添加硫氰酸根0.25mg/kg、0.50mg/kg、1.50mg/kg和5.00mg/kg，每個濃度水平進行6次重復試驗。測得硫氰酸根的回收率和精密度匯總于表5?；厥章史秶?3.7%～100.1%之間，相對標準偏差范圍在4.5%～13.4%之間。通過比對6家單位的結果顯示，本方法具有良好的重復性與再現(xiàn)性。

表4 生乳中硫氰酸根添加回收率及實驗室內精密度試驗結果

表5 生乳中硫氰酸根添加回收率及實驗室間精密度試驗結果

3 結論

本研究對生乳中硫氰酸根測定離子色譜法的色譜柱、選擇性、前處理條件、線性范圍、方法檢出限與定量限、實驗室內加標回收率與精密度、實驗室間加標回收率與精密度方面進行了優(yōu)化和考察。從試驗結果可以看出該方法的檢出限為0.25mg/kg，定量限為0.75mg/kg，實驗室內回收率范圍84.6%～104.1%，相對標準偏差范圍1.2%～9.2%，實驗室間回收率范圍93.7%～100.1%，相對標準偏差范圍4.5%～13.4%，該方法操作簡便，檢測結果準確、可靠。