藺惠良，蘇碩青，王志仙，趙增元，郭偉婷，朱宏波，馮春濤，余文莉,2

（1.石家莊天泉良種奶牛有限公司，石家莊 050200；2.河北省奶牛良種繁育工程技術(shù)研究中心，石家莊 050200；3.石家莊市畜牧技術(shù)推廣站，石家莊 050000）

隨著哺乳動物胚胎工程技術(shù)的深入研究和快速發(fā)展，胚胎移植技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于牛的遺傳育種與良種快速擴繁。PCR胚胎性別鑒定技術(shù)的應(yīng)用使犢牛的性別控制準確率達到98%以上，進一步增強了牛胚胎移植技術(shù)的實用性。但從完整胚胎上切取數(shù)個卵裂球的操作是否會大幅降低移植妊娠率，是技術(shù)的提供者與接受者都十分關(guān)注的問題。本文從胚胎類型、質(zhì)量、發(fā)育階段、取樣細胞數(shù)及體外存放時間等方面進行深入研究，以期制定并進一步優(yōu)化提高牛取樣后胚胎移植妊娠率的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 牛胚胎

荷斯坦牛常規(guī)冷凍胚胎（整胚）和取樣鑒定后的冷凍雌性胚胎。

胚胎發(fā)育階段：緊縮桑葚胚、早期囊胚、囊胚和擴張囊胚。

胚胎質(zhì)量：1、2級。

1.1.2 主要藥品

CIDR:1.38g孕酮/只；FOLLTROPIN-V:400mg、FSH 10mg/瓶（中科院生物所）；HOLDING（新西蘭ICP公司）；PGF2α（齊魯動物保健品有限公司）；鹽酸利多卡因（山東華魯制藥有限公司）。

1.1.3 主要儀器

實體顯微鏡（OLYMPUS SZ1145），倒置顯微鏡（OLYMPUS CK40），胚胎分割儀(WETZLAR)，冷凍儀（CL-5500）。

1.1.4 主要耗材和溶液

六孔平皿(PETS公司)，φ35mm平皿、φ60mm平皿(BECTON DICKINSON公司)，顯微分割刀、200μL通用吸頭（AB Technology, Inc, Pullman WA），胚胎分割液(SPLITTING ，自制)，胚胎保存液（HOLDING，ICP公司)，1.5mol/L乙二醇胚胎冷凍液（EG，ICP公司）。

1.2 方法

1.2.1 供體牛超排處理

選擇12月齡以上的荷斯坦育成牛進行超排處理。供體牛體況評分在2.75～3.25之間。在超數(shù)排卵處理前加強飼養(yǎng)管理，補充維生素、礦物質(zhì)和微量元素。供體牛用CIDR-FSH-PG-GnRH法超排處理，用常規(guī)非手術(shù)法采集胚胎。

1.2.2 胚胎取樣方法

將胚胎分割儀與倒置顯微鏡固定在一起，將顯微分割刀固定在顯微操作儀的操作手上。在φ60mm平皿中做一個50μL的胚胎分割液滴，每個胚胎在取樣前在胚胎分割液中洗5遍，之后放入分割滴中，胚胎被放大100倍進行分割取樣。樣品取走后，用200μL通用吸頭吸取50μL的胚胎保存液，從分割液滴中將取樣后的胚胎吸起，放入6孔平皿對應(yīng)的胚胎保存液滴中，等待冷凍。

1.2.3 胚胎冷凍

常規(guī)胚胎（整胚）與取樣后的胚胎冷凍方法相同。胚胎在EG冷凍液中平衡5min并裝入0.25mL細管后，放于冷凍儀上進行程序化冷凍。冷凍程序：-6℃，平衡5min，植冰，平衡5min，0.5℃/min降溫至-35℃投入液氮。

1.2.4 胚胎解凍

將胚胎從液氮中取出直接放入32～35℃水浴中10s，將細管外的水跡拭干，將胚胎直接推入HOLDING液中洗3～4次，采用四段式將胚胎吸入0.25mL塑料細管內(nèi)移植。

1.2.5 受體牛同期發(fā)情處理

采用CIDR+PG法：受體牛發(fā)情周期的任一天上午放CIDR，并肌肉注射維生素ADE 10mL/頭，記為第0天，第9天上午7:00時注射PGF2α0.6mg/頭，并肌肉注射維生素ADE 10mL/頭，第12天上午7:00時撤CIDR，第13天觀察發(fā)情并做好記錄，第 21天移植。

1.2.6 胚胎移植及妊娠檢查

采用非手術(shù)法移植。直腸檢查發(fā)情后第7～8天的受體，選擇黃體發(fā)育良好的受體牛進行移植。將胚胎移植到有黃體一側(cè)的子宮角，并保證胚胎發(fā)育階段與受體牛生理階段的同步性。采取直腸把握法檢查移植后60～90d的受體牛妊娠情況。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

本試驗中采用的統(tǒng)計方法全部為χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 切割取樣對胚胎移植妊娠率的影響

表1 胚胎類型對胚胎移植妊娠率的影響

如表1所示，經(jīng)取樣性鑒后的胚胎，冷凍-解凍后的移植妊娠率為48.74%，相比常規(guī)冷凍-解凍胚胎移植妊娠率較低，但是差異不顯著（P＞0.05），表明取樣對胚胎的移植妊娠率無明顯影響。

2.2 取樣胚胎的質(zhì)量對移植妊娠率的影響

胚胎質(zhì)量是影響胚胎移植妊娠率的關(guān)鍵因素。由表2可見，1級胚胎的妊娠率（48.72%），顯著高于2級胚胎的妊娠率（38.41%）（P＜0.01）。

表2 胚胎質(zhì)量對胚胎移植妊娠率的影響

2.3 取樣胚胎的發(fā)育階段對移植妊娠率的影響

沖胚時，所獲得的胚胎為發(fā)情7～8d的胚胎，胚胎的發(fā)育階段為桑葚胚、早期囊胚、囊胚、擴張囊胚。本試驗中，對取樣后并冷凍的桑葚胚、早期囊胚、囊胚和擴張囊胚進行移植妊娠率的比較，結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)，擴張囊胚妊娠率最高，為73.33%，與囊胚妊娠率（54.55%）無顯著差異（P＞0.05），但顯著高于早期囊胚妊娠率（46.56%）和桑葚胚妊娠率（45.77%）（P＜0.05）。囊胚妊娠率（54.55%）相較早期囊胚妊娠率（46.56%）無顯著差異（P＞0.05），而相比桑葚胚妊娠率（45.77%）差異顯著（P＜0.05）。桑葚胚妊娠率與早期囊胚妊娠率之間無顯著差異（P＞0.05）。

表3 胚胎發(fā)育階段對胚胎移植妊娠率的影響

2.4 不同取樣細胞數(shù)對移植妊娠率的影響

本試驗通過對相同質(zhì)量的胚胎進行不同細胞數(shù)的取樣來檢測其對移植妊娠率的影響。從表4和5中可以發(fā)現(xiàn)，無論是1級胚胎還是2級胚胎，當取樣細胞數(shù)在4～6個時，移植妊娠率最高，分別為49.68%與40.58%，在取8～10個細胞數(shù)時，移植妊娠率分別為46.63%和37.00%，其妊娠率相比4～6個細胞數(shù)要低。即隨著取樣數(shù)量的增加其移植妊娠率有所下降。但在試驗中取樣細胞數(shù)在1～3個的胚胎并沒有獲得較高的移植妊娠率，這可能是由于取樣切割過程中難度的增加對胚胎造成的隱性損傷程度更大，導(dǎo)致其移植妊娠率降低。對于有散死細胞（SD）的1級胚胎而言，其胚胎質(zhì)量有所降低，所以移植妊娠率低于其他組；對于有散死細胞（SD）的2級胚胎來說，其移植妊娠率與取樣1～3個的相當并高于取樣8～10個的，這可能是活細胞數(shù)量沒有降低又清除了死細胞殘留物的結(jié)果。但表4、表5各組間移植妊娠率差異均不顯著（P＞0.05）。

表4 不同取樣數(shù)量對胚胎移植妊娠率的影響

表5 不同數(shù)量對胚胎移植妊娠率的影響

2.5 取樣后胚胎冷凍前在體外放置時間對移植妊娠率的影響

本試驗檢測了在取樣操作中，胚胎在體外放置時間的長短對移植妊娠率的影響。如表6所示，小于2h的妊娠率為47.22%，在2～4h之間的妊娠率為45.91%，大于4h的妊娠率為43.87%（P＞0.05）。盡管各組間沒有顯著差異，但隨著胚胎在體外放置時間的延長，移植妊娠率呈現(xiàn)下降的趨勢，所以最好在4h之內(nèi)完成胚胎冷凍。

表6 胚胎在體外放置不同時間對移植妊娠率的影響

3 討論

3.1 取樣胚胎類型對移植妊娠率的影響

本試驗進行了取樣性鑒凍胚與常規(guī)凍胚移植妊娠率的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，取樣性鑒凍胚的移植妊娠率為48.74%，比常規(guī)凍胚的移植率49.49%低了0.75個百分點，兩者的移植妊娠率無顯著差異，這與Lopes所報道的一致[1]。

3.2 取樣胚胎質(zhì)量及取樣細胞數(shù)對移植妊娠率的影響

有文章報道[2]，胚胎質(zhì)量是移植妊娠率高低的決定因素。本試驗對1級和2級胚胎進行移植，結(jié)果如表1所示，1級胚胎妊娠率為48.72%，顯著高于2級胚胎妊娠率的38.41%。這一結(jié)果與Arreseigor[3]的觀點相一致。同時這個結(jié)果進一步驗證了許瑞鋒等[4]的研究結(jié)果，即胚胎質(zhì)量的優(yōu)、良是影響胚胎在子宮內(nèi)著床的關(guān)鍵因素。在1級胚胎中取4～6個細胞時，移植妊娠率最高，為49.68%，其他組的結(jié)果均低于4～6個細胞取樣組。在2級胚胎中同樣是取樣在4～6個細胞組中的移植妊娠率最高，以上數(shù)據(jù)說明不同取樣細胞數(shù)對胚胎移植妊娠率有一定的影響。

3.3 取樣胚胎發(fā)育階段對移植妊娠率的影響

超數(shù)排卵所獲得的體內(nèi)胚胎的胚齡為6～10日齡，按胚胎發(fā)育階段，將胚胎可分為桑葚胚、早期囊胚、囊胚、擴張囊胚和孵化胚胎[5]。有文獻報道[6，7]，在胚胎移植時囊胚移植妊娠率比桑葚胚高。Shea[8]的研究認為桑葚胚和囊胚的移植妊娠率相似。本試驗的研究結(jié)果顯示，擴張囊胚的移植妊娠率最高，為73.33%，其次是囊胚，為54.55%，早期囊胚和桑葚胚的移植妊娠率較低，分別為46.56%和45.77%，與Hasler的研究結(jié)果一致。

3.4 取樣胚胎冷凍前在體外放置時間對移植妊娠率的影響

為了獲得理想性別的胚胎，其中一種途徑是在胚胎移植前對胚胎切割取樣并鑒定雌雄，因此需要在體外放置一定時間再進行冷凍，而胚胎長時間在體外存放可能會對其移植妊娠率有一定的影響。本試驗對取樣凍胚進行移植得出的結(jié)果為：在體外放置時間≤2h的胚胎移植妊娠率為47.22%，在體外放置2～4h的胚胎移植妊娠率為45.91%，在體外放置4h以上的胚胎移植妊娠率為43.87%，這表明隨著胚胎在體外存放時間的延長胚胎移植妊娠率有下降的趨勢，這一結(jié)果與Pettit等[9]和Wright[10]的研究結(jié)果一致。在實際操作中，應(yīng)盡可能將胚胎在體外放置時間控制在4h以內(nèi)。