胡蓆寶，田晶晶，袁紅霞

胃食管反流?。℅ERD）是指胃酸和（或）胃內容物反流到食管、口腔甚至呼吸道引起的一系列癥狀及并發(fā)癥[1]。反流性食管炎（RE）屬于GERD范疇，是一種常見的慢性消化系統(tǒng)疾病，是指胃和（或）十二指腸的內容物反流到食管，引起食管黏膜出現(xiàn)炎癥改變、點片狀糜爛，甚至形成潰瘍。RE的主要臨床癥狀表現(xiàn)為胸骨后燒灼感、燒心、反酸等癥狀。近年來，伴隨著人們生活方式、飲食結構的改變，RE的發(fā)病率逐年上升[2-3]。西藥治療RE的藥物包括PPI、黏膜保護劑及促胃動力藥等，可以短期控制RE癥狀，但是長期效果不明顯，而且不能從根本上解決問題，存在著復發(fā)率高等弊端[4-5]。

目前，多數(shù)中醫(yī)臨床學者采用不同方劑辨證論治RE，均取得了比較滿意療效，線粒體(脾)是機體細胞正常運行的“氣血生化之源”，在機體炎癥調控中發(fā)揮核心作用，改善線粒體功能對于炎癥相關疾病的治療具有重要意義，呼吸鏈complex Ⅰ和complex Ⅳ在線粒體能量代謝和維持線粒體結構、功能過程中具有非常重要的作用。本實驗擬通過觀察中藥食管康顆粒對RE模型大鼠食管黏膜線粒體呼吸鏈complex Ⅰ和complex Ⅳ活性的表達情況，探討食管康治療RE的作用機制，從線粒體代謝角度為RE的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 64只健康的雄性Wistar大鼠購于斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002，常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室紫外線照射消毒，飼養(yǎng)籠過氧乙酸消毒，保持室內相對恒溫，濕度控制在50%～60%，每日自由飲用自來水，進食標準的顆粒食物。

1.1.2 實驗藥品 （1）食管康組：旋覆花15 g，代赭石5 g，炙甘草10 g，人參10 g，半夏10 g，延胡索15 g，黃連18 g，吳茱萸3 g等。以上藥味采用中藥配方顆粒(江陰市天江藥業(yè)有限公司)加熱水（水溫100 ℃）約200 mL充分攪拌。中藥藥材全部由天津市南開醫(yī)院提供，根據(jù)人與動物的體表面積進行換算，并煎制成1 g/mL生藥的溶液，根據(jù)人與動物給藥劑量換算，大鼠每日給藥劑量為生藥10 g/kg。（2）西藥對照組：蘭索拉唑腸溶片聯(lián)合枸櫞酸莫沙必利分散片，研為細粉末后，配制濃度為0.15 mg/mL的混懸液備用。

1.1.3 實驗試劑與器械 電子天平，購自德國Sartorius公司，型號：Cubis? MSA224S-000-DA；電熱恒溫水浴槽，型號：HWS-24；-80 ℃低溫冰箱，型號：MDF-C8V(N)；4 ℃低溫冰箱，型號：HXC-106；脫色搖床，型號TS-100；電泳儀，型號BG-subMIDI；低溫離心機，購自德國Sigma，型號3-30K；SDS-PAGE，凝膠成像系統(tǒng)UVP，型號GelDoc-It310；ChemiDoc MP化學發(fā)光成像系 統(tǒng) Bio-rad， 型 號 170-8280。Anti-complexⅠ一抗和Anti-complex Ⅳ一抗購于Invitrogen公司，β-actin購自杭州華安生物技術有限公司，二抗羊抗鼠和羊抗兔IgG購自圣克魯斯生物技術公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將64只大鼠隨機分為4組：正常對照組、模型組、西藥治療組和食管康組，每組16只。采用改良后的“食管-十二指腸端側吻合術”方法造模[6]，應用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射，麻醉后將造模大鼠固定在手術板上，備皮消毒后，取上腹部正中的劍突下約0.5 cm處，縱行切開皮膚約2 cm，然后沿腹白線剪開肌層和腹膜，將胃提出，剪斷肝胃韌帶，顯露食管，分離食管下段迷走神經及血管，絲線結扎賁門，固定食管，預防食管回縮，從賁門上0.3 cm處切斷食管；縫合賁門并荷包包埋入胃中，保留全胃；在距幽門1 cm處側壁避開血管縱行切開十二指腸壁約0.5 cm；隨后將食管下端全層與十二指腸切口行端側吻合（6/0帶線縫合針縫合），前后左右四壁四針縫合即可，縫合之后盡量輕輕將胃、食管、十二指腸按原位置回納，以避免感染及粘連；關腹前于腹腔內注射鹽酸左氧氟沙星注射液（1.5 mg/kg，揚子江藥業(yè)集團有限公司），然后進行分層縫合，迅速關腹，消毒皮膚。術后24 h禁食不禁水，術后3 d內，每天每只大鼠腹腔注入鹽酸左氧氟沙星注射液1.5 mg/kg，且給予注射用葡萄糖鹽水飲用，此后常規(guī)喂養(yǎng)。將成模的動物隨機分為三組：模型組、食管康組及西藥組。

1.2.2 藥物干預 正常對照組16只大鼠與各治療組同日開始，用生理鹽水1 mL/100 g體重進行灌胃，2次/d，與各治療組同時處死。模型對照組16只大鼠于造模后第6天用生理鹽水1 mL/100 g體重進行灌胃，2次/d，與治療組同日處死。食管康組、西藥治療組2組，每組16只大鼠。于造模術第6天開始，用相應藥液1 mL/100 g體重進行灌胃，2次/d，治療14天后，處死各組動物，開始進行指標檢測。

1.2.3 處死及取材 動物禁食不禁水1天后處死，用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，開腹后盡快取出食管縱切一分為二，一份放入10%福爾馬林液中送病理科，另一份稱重之后用生理鹽水沖洗，放入液氮中，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.4 觀察指標及指標檢測方法 （1）食管黏膜的肉眼表現(xiàn)：各組大鼠麻醉之后，迅速進行開腹，取自胃與食管交界上0.5 cm處向咽喉部方向截取長約1.5～2.0 cm的食管，用冰生理鹽水將食管腔漂洗后，肉眼觀察食管大體的表現(xiàn)，并進行肉眼RE分級，之后迅速將食管組織放入10%福爾馬林固定液中，防止自溶；（2）病理形態(tài)學觀察：將固定好的食管組織送病理科制備食管組織石蠟切片進行HE染色，在光學顯微鏡下觀察病理組織學分級（參考2004年由中華醫(yī)學會消化內鏡分會頒布的《反流性食管炎診斷及治療指南》見表1、表2。）（3）食管組織complex Ⅰ、Ⅳ活性的檢測：應用Western blotting法測定標本中大鼠食管組織complex Ⅰ、Ⅳ的活性，測定的過程按照試劑盒說明書進行嚴格操作。

表1 反流性食管炎肉眼表現(xiàn)分級

1.3 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠死亡原因分析 正常組大鼠在實驗過程中無死亡，造模組大鼠于處死前，48只大鼠共死亡8只，死亡率約為16.67%。其中2只死于彌漫性腹膜炎，2只死于吻合口狹窄，1只死于腸梗阻，3只死于吸入性肺炎。剩余大鼠各組為模型組12只，食管康組15只，西藥組13只。

2.2 食管黏膜肉眼的表現(xiàn) 正常組大鼠的食管黏膜光滑，無充血水腫表現(xiàn)；灌胃14天后，模型組大鼠食管下段黏膜水腫，顏色鮮紅，可見點片狀充血、糜爛，部分融合為潰瘍；食管康組大鼠食管黏膜結構光滑，少數(shù)食管下段黏膜輕度充血水腫，未見糜爛及潰瘍；西藥組大鼠食管黏膜結構相對完整，部分食管可見條索狀充血，少數(shù)可見條索狀糜爛，未見明顯潰瘍。各組大鼠RE肉眼分級分布及積分情況見表3。

2.3 食管黏膜光鏡下表現(xiàn) 正常組大鼠食管光鏡下黏膜層表面為完整的鱗狀上皮，其基底的細胞層有少許內分泌細胞；模型組大鼠食管黏膜層有明顯的炎性細胞浸潤，局部黏膜糜爛；食管康組大鼠食管黏膜上皮恢復，炎性細胞明顯減少；西藥組大鼠食管黏膜可見炎細胞彌漫水腫，基層仍可見炎細胞浸潤，各組大鼠RE光鏡下分級分布及積分情況見表4，圖1～4。

表4 各組大鼠食管黏膜病理組織學分級

圖1 正常組大鼠食管黏膜（×400）

圖2 模型組大鼠食管黏膜（×400）

圖3 西藥組大鼠食管黏膜（×400）

圖4 食管康組大鼠食管黏膜（×400）

2.4 食管組織complexⅠ、Ⅳ活性的檢測 模型組大鼠食管組織complexⅠ、Ⅳ活性較正常組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），食管康組及西藥組大鼠食管組織complexⅠ、Ⅳ活性較模型組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），食管康組與西藥組比較，大鼠食管組織complexⅠ、Ⅳ活性表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表5，圖 4，5。

表5 complexⅠ、Ⅳ灰度值參數(shù)與內參β-actin灰度值參數(shù)比值

圖4 各組大鼠食管組織complexⅠ、Ⅳ活性表達情況

圖5 各組大鼠食管組織complexⅠ、Ⅳ活性表達情況

3 討論

中醫(yī)學并無RE的病名，根據(jù)該病的主癥及臨床表現(xiàn)歸于中醫(yī)“反胃”“吐酸”“嘔吐”“噎膈”等范疇。RE的病位主要在食管，與肝、脾、胃等關系密切，基本的病機為脾胃虛弱，而病機之關鍵則為中焦氣機升降的失常。課題組成員提出“脾胃虛弱”為RE的發(fā)病之本，病機關鍵為“肝胃不和，胃氣上逆”，情志不暢、飲食不節(jié)、勞倦或久病等致脾胃虛弱，肝在五行屬木,主動,主升，主疏泄，肝為血之藏,司情志，喜條達、惡抑郁。若脾胃虛弱，肝木偏亢而克制脾土，即“土虛木乘”，而致中焦氣機升降失常，脾胃運化功能失職，氣機郁結，肝氣夾胃濁上逆,出現(xiàn)肝胃不和，胃氣上逆，發(fā)生RE。故臨證中食管康顆粒治療各種類型的RE療效顯著[7-8]。

食管康顆粒是在《傷寒論》中經方“旋覆代赭湯”的基礎上加左金丸，芍藥甘草湯，再佐以延胡索，郁金，丹參而成，其方證要點為脾胃虛弱，肝胃不和，胃氣上逆。旋覆花降氣化痰，降逆止嘔，其質輕而氣主下，可降胃氣無傷脾礙胃之弊，并有疏肝中郁結之功；代赭石功善降逆止嘔，下氣降痰，該藥重鎮(zhèn)降逆可療胃氣不降，開胸膈，墜痰涎治喘息，平肝降胃鎮(zhèn)沖，治沖氣上逆，與旋覆花合用，佐助降逆化痰止嘔之效，降逆化痰，益氣和胃；半夏辛開，燥功善降逆和胃止嘔，燥濕化痰；黃連清胃熱，瀉肝火；吳茱萸疏肝和胃，降逆止嘔，二者為《丹溪心法》中之左金丸，辛開苦降，肝胃同調，佐君藥增強清肝和胃之功，共為臣藥；白芍養(yǎng)肝血，益肝陰，緩急止痛；由于此病多病程較長，久病則入絡化瘀，加丹參活血止痛，郁金清熱疏肝，解郁除煩，共為佐藥；炙甘草健脾和胃，調和諸藥?？v觀全方，配伍嚴謹，協(xié)調升降，平調氣血，降中有升，升中有降，降中有補，標本兼顧，諸藥配合，共成健脾益氣，疏肝和胃，達到重建中焦氣機的升降功能，使氣逆得除，臟腑和諧狀態(tài)得復。

線粒體是半自主性的細胞器，是機體細胞正常運行的“動力工廠”，可以氧化分解全身的營養(yǎng)物質（水谷精微），為全身細胞的生命活動提供重要的能量[9]，是機體細胞正常運行的“氣血生化之源”,也就是說機體細胞的中醫(yī)之“脾”。與線粒體呼吸鏈的電子傳遞偶聯(lián)形成的跨線粒體內膜質子梯度是生命活動中腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）合成最主要的動力。線粒體是通過三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化的過程, 把營養(yǎng)物質(水谷精微)氧化生成ATP(氣)，同時利用甘氨酸和琥珀酸單酰CoA，共同合成血紅素(“血”)，可見，線粒體(脾)是機體細胞正常運行的“氣血生化之源”。

呼吸鏈位于線粒體內膜上，糖、脂肪、蛋白質在代謝過程中形成電子，通過線粒體呼吸鏈依次傳遞，最終產生ATP，為組織細胞提供能量。線粒體內膜呼吸鏈復合體包括complexⅠ(NADH泛醌氧化還原酶)、complexⅡ(琥珀酸泛醌氧化還原酶)、complex Ⅲ(細胞色素C還原酶)、complexⅣ(細胞色素C氧化酶)、complexⅤ(ATP合成酶)及一系列的輔酶[10-11]，線粒體呼吸鏈復合物的活性濃度變化直接反映著線粒體呼吸功能的變化[12]，其可保護線粒體膜結構的完整性，改善氧化磷酸化的功能，對維持機體正常的能量代謝有重要意義[13-14]。

呼吸鏈complex Ⅰ是線粒體呼吸鏈的首個門戶，在線粒體能量代謝過程中具有非常重要的作用，其在電子傳遞的過程中泵出偶聯(lián)質子，形成了線粒體基質和膜間隙的質子梯度，從而可以促進線粒體ATP的合成[15-16]。呼吸鏈complex Ⅳ位于呼吸鏈的末端，催化細胞色素氧化，亦可以促進ATP的合成，其酶活性的發(fā)揮對維持線粒體結構、功能有很重要的意義。研究證明[17]，脾虛組大鼠脾臟的線粒體complex（Ⅰ-Ⅳ）的活性均明顯低于正常組，證實脾虛證中脾臟組織的ATP合成能力出現(xiàn)障礙，考慮與其氧化磷酸化過程complex活性的改變有相關性。

綜上所述，RE模型組大鼠食管組織中complex Ⅰ、Ⅳ活性較正常組明顯降低，而經過食管康顆粒健脾益氣，疏肝和胃治療后，達到重建中焦氣機的升降功能，使食管組織中complex Ⅰ、Ⅳ活性升高，提示食管康顆粒治療RE的機制，可能為增加機體組織線粒體呼吸鏈酶的活性，保持呼吸鏈的完整性，提高線粒體氧利用的能力和氧化磷酸化的功能，從而改善線粒體膜結構的完整性，改善食管下括約肌的正常舒縮，減少反流的發(fā)生，從而達到治療RE的目的。