方梓秋，陳國慶*，吳亞敏

1. 江南大學(xué)理學(xué)院，江蘇 無錫 214122 2. 江蘇省輕工光電工程技術(shù)研究中心，江蘇 無錫 214122

引 言

核黃素，是一種具有核糖醇側(cè)鏈的異咯嗪類衍生物，是人體中重要的氧化還原酶的輔酶。 越來越多的臨床研究表明，核黃素對肝臟和腎臟組織損傷有著顯著的恢復(fù)作用[1]。 同時(shí)在腫瘤治療的過程，核黃素也起到關(guān)鍵作用[2]。 所以，核黃素對人體的重要性不可忽視。 近年來，國內(nèi)外學(xué)者對核黃素的光物理和光化學(xué)性質(zhì)做了大量的研究。 如環(huán)境因素對核黃素?zé)晒馓匦缘挠绊?、黃素中發(fā)色團(tuán)的電子轉(zhuǎn)移活性問題[3]以及在BLUF(blue light sensing using flavin)發(fā)光材料領(lǐng)域的應(yīng)用[4]都受到人們的廣泛關(guān)注。 此外，對于黃素類物質(zhì)的量子化學(xué)計(jì)算也已得到初步研究[5]。

在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合量子化學(xué)計(jì)算，研究溶劑對核黃素光譜特性的影響。 理論計(jì)算得到吸收峰和發(fā)射峰值，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合較好； 分析核黃素前線分子軌道，了解受激躍遷方式； 計(jì)算不同溶劑中核黃素分子偶極矩值，從理論上闡明光譜變化與偶極矩之間的關(guān)系。 最后，考慮分子間氫鍵作用對核黃素光譜性質(zhì)的影響。 從實(shí)驗(yàn)和理論兩方面進(jìn)一步了解核黃素的光學(xué)特性，其結(jié)果對核黃素在藥理學(xué)及發(fā)光材料等領(lǐng)域的研究提供一定的幫助。

1 實(shí)驗(yàn)部分

核黃素(≥97.5%)購買于天津光復(fù)精細(xì)化工研究所； 溶劑分別為超純水、二甲基亞砜和三氯甲烷，有機(jī)溶劑均為國藥化學(xué)試劑有限公司提供的分析純試劑，分別配制成濃度為10 μg·mL-1的核黃素溶液。 實(shí)驗(yàn)采用英國Edinburgh FLS920P型穩(wěn)態(tài)和時(shí)間分辨熒光光譜儀，測量核黃素在上述三種溶劑中的穩(wěn)態(tài)吸收光譜、熒光光譜及時(shí)間分辨熒光光譜。 其中，測量熒光光譜時(shí)，激發(fā)波長為444 nm，光源為氙燈； 時(shí)間分辨熒光的測量利用系統(tǒng)中時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)技術(shù)，激發(fā)光源為中心波長374 nm的半導(dǎo)體激光器。 所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下完成。

2 量子化學(xué)計(jì)算

采用密度泛函理論中的B3LYP泛函，在6-31G(d, p)基組水平上對核黃素分子的基態(tài)幾何結(jié)構(gòu)優(yōu)化，并通過頻率分析，優(yōu)化結(jié)構(gòu)無虛頻，確認(rèn)優(yōu)化的結(jié)構(gòu)處于勢能面的能量最低點(diǎn)。 利用優(yōu)化好的結(jié)構(gòu)，采用含時(shí)密度泛函理論，結(jié)合基于密度的溶劑化模型(the solvation model based on density, SMD)[7]，在B3LYP/6-311+G(d, p)水平上計(jì)算核黃素分子表面靜電勢及在不同溶劑中吸收和發(fā)射光譜。 全部計(jì)算均采用Gaussian 09程序完成。 分子表面靜電勢分析和弱相互作用分析均采用Multiwfn程序[8]完成。 結(jié)構(gòu)相互作用的等值面圖使用VMD程序[9]繪制。

3 結(jié)果與討論

3.1 穩(wěn)態(tài)吸收和熒光光譜

圖1為核黃素在三種不同極性溶劑中的穩(wěn)態(tài)吸收光譜和歸一化熒光光譜。 可以發(fā)現(xiàn)，核黃素的主吸收峰幾乎不隨溶劑極性的改變而變化，峰值波長在443～445 nm范圍內(nèi)； 而次級吸收峰隨溶劑變化的位移程度較大，表明核黃素次級吸收躍遷對溶劑極性更加敏感，與前人研究結(jié)果一致[10]。 同時(shí)，核黃素的熒光峰隨著溶劑極性的增大產(chǎn)生明顯的紅移現(xiàn)象。 這可能是由于溶劑與基態(tài)和激發(fā)態(tài)核黃素分子的相互作用程度不同引起。 表1中列出了核黃素在三種溶劑中主吸收峰和熒光峰的理論計(jì)算數(shù)據(jù)，與實(shí)驗(yàn)值吻合較好。

圖1 核黃素在水、DMSO和三氯甲烷中的吸收光譜和歸一化熒光光譜

Fig.1Absorptionspectraandnormalizedfluorescencespectraofriboflavininwater,DMSOandchloroform

表1 核黃素在三種溶劑中的光譜信息

圖2 核黃素前線分子軌道(a)HOMO和(b)LUMO示意圖

Fig.2Viewofthefrontiermolecularorbitals(HOMOandLUMO)forriboflavinstructure

通過分子偶極矩解釋吸收光譜和熒光光譜位移程度不同的原因。 通過基態(tài)和激發(fā)態(tài)偶極矩的計(jì)算，說明溶質(zhì)分子的電子激發(fā)和溶劑化作用引起電荷的重新分布，同時(shí)影響著溶質(zhì)分子的偶極矩。 表2中列出核黃素在三種溶劑的基態(tài)和激發(fā)態(tài)偶極矩值計(jì)算結(jié)果。 由計(jì)算結(jié)果可知，激發(fā)態(tài)核黃素分子的偶極矩高于基態(tài)，溶劑與激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用也強(qiáng)于與基態(tài)分子的相互作用，使得吸收峰與熒光峰出現(xiàn)不同程度的變化。 隨著溶劑極性的增加，激發(fā)態(tài)偶極矩增大，溶劑與溶質(zhì)的相互作用的增強(qiáng)，使得核黃素分子能級降低。 核黃素?zé)晒獍l(fā)射躍遷對應(yīng)于LUMO→HOMO軌道躍遷，HOMO和LUMO之間的能級間隙的ΔΕ直接影響著躍遷能。 核黃素在三種溶劑中的能帶間隙值ΔE列于表2中。 相比于非極性溶劑，激發(fā)態(tài)核黃素分子更容易被極性溶劑所穩(wěn)定，躍遷能量降低，熒光峰會隨溶劑極性增大發(fā)生紅移。

表2 核黃素在三種溶劑中的偶極矩(Debye)和能級間隙(ΔE)計(jì)算值

3.2 時(shí)間分辨熒光光譜

圖3 核黃素在374 nm激發(fā)下三種溶劑中的熒光衰減曲線

表3中列出了核黃素在水、DMSO和三氯甲烷中的熒光壽命。 由表3可以看出，核黃素最低激發(fā)態(tài)的壽命明顯地依賴溶劑極性，且核黃素在氫鍵給體溶劑中的熒光壽命要長于在非氫鍵給體溶劑中的熒光壽命。 壽命的延長可歸因于核黃素與氫鍵給體溶劑(水)之間的分子間氫鍵相互作用，阻礙了分子的運(yùn)動，減少了分子在激發(fā)態(tài)的非輻射躍遷，從而熒光壽命得到延長。

表3 核黃素在三種溶劑中時(shí)間分辨熒光衰減信息

3.3 氫鍵作用

由3.2節(jié)時(shí)間分辨熒光光譜結(jié)果可知，核黃素分子在氫鍵給體溶劑中，不僅存在由溶劑參數(shù)引起的一般溶劑作用，還存在溶質(zhì)和溶劑分子之間特殊的相互作用，如氫鍵。 因此在隱式溶劑模型的基礎(chǔ)上，在核黃素分子周圍引入水分子來研究它們之間的氫鍵相互作用及其對光譜的影響。

圖4 (a) 核黃素分子表面靜電勢分布； (b) 核黃素與水分子相互作用分析模型

核黃素分子表面含氧官能團(tuán)能夠作為主要的吸附中心與水分子形成氫鍵，因此研究分子表面靜電勢[12]對于預(yù)測氫鍵形成位點(diǎn)具有重要的意義。 核黃素分子表面靜電勢分布如圖4(a)所示。 可以看出，異咯嗪環(huán)上的兩處羰基和核糖醇側(cè)鏈尾端的羥基等主要含氧官能團(tuán)的氧原子由于孤對電子的存在，使得周圍呈現(xiàn)較大的負(fù)電勢，而氫原子周圍呈現(xiàn)較大的正電勢。 從上述吸收躍遷分析可知，電荷分布幾乎不涉及核糖醇側(cè)鏈，且靜電勢的極小值點(diǎn)出現(xiàn)在兩個(gè)羰基處，分別為-47.142和-47.512 kcal·mol-1。 說明兩羰基處更易與水分子發(fā)生以靜電力為主的氫鍵作用，因此基于之前的分析和對計(jì)算效率的考慮，構(gòu)建了如圖4(b)所示的分子模型。 通過含時(shí)密度泛函理論，對該團(tuán)簇模型的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜進(jìn)行計(jì)算。 吸收峰值和熒光峰值分別為439.23和532.92 nm，計(jì)算結(jié)果均比僅通過隱式溶劑模型得到的結(jié)果更接近實(shí)驗(yàn)值，說明在水中考慮氫鍵作用更加合理。

基于約化密度梯度函數(shù)(reduced density gradient，RDG)和電子密度(ρ)之間的關(guān)系，有研究開發(fā)出一種有效而便捷的方法來研究弱相互作用，稱為RDG方法[13-14]。 通過繪制RDG和ρ乘以電子密度Hessian矩陣的第二大本征值函數(shù)sign(λ2)之間的散點(diǎn)圖，并將ρ與本征值函數(shù)的乘積函數(shù)投影到RDG等值面上，可以在實(shí)空間中表征各種類型和強(qiáng)度的弱相互作用，研究對象主要是氫鍵(藍(lán)色)、范德華力(綠色)和位阻作用(紅色)。 散點(diǎn)圖上也出現(xiàn)若干垂直于橫坐標(biāo)的“尖釘”(原文中稱為spike)，spike上的點(diǎn)正對應(yīng)于弱相互作用區(qū)域。 圖5(a)和(b)分別為核黃素與水分子相互作用的填色散點(diǎn)圖以及顏色對應(yīng)的RDG填色等值面圖。

圖5 (a) 核黃素與水分子填色散點(diǎn)圖； (b) 團(tuán)簇模型RDG填色等值面圖

RDG填色等值面圖可以清晰地呈現(xiàn)出核黃素分子與水分子的相互作用區(qū)域。 核黃素兩處羰基的氧原子和水分子的氫原子之間，氨基上氫原子與水分子的氧原子之間均存在藍(lán)色等值面，表明存在氫鍵相互作用； 在散點(diǎn)圖中對應(yīng)最左側(cè)藍(lán)色spike，橫坐標(biāo)為-0.028 a.u.。 同時(shí)，兩個(gè)水分子之間存在淡藍(lán)、偏綠色的等值面，說明水分子二聚體以范德華作用和弱氫鍵的形式結(jié)合，對應(yīng)散點(diǎn)圖中橫坐標(biāo)為-0.022 a.u.的spike。 此外，兩處羰基與兩個(gè)水分子之間構(gòu)成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)中還出現(xiàn)小片段的棕色、淡紅色等值面，表明分子間存在一定的位阻作用。 分析認(rèn)為每個(gè)原子都會占據(jù)一定的空間，在以較強(qiáng)的相互吸引作用構(gòu)成帶張力的結(jié)構(gòu)時(shí)，會導(dǎo)致能量升高并產(chǎn)生斥力，所以體系需在位阻效應(yīng)存在的情況下保持狀態(tài)穩(wěn)定。 由氫鍵為主導(dǎo)，與部分范德華力和位阻效應(yīng)共同作用下所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使得核黃素剛性得到增強(qiáng)，減小化學(xué)鍵的振動和轉(zhuǎn)動，降低非輻射躍遷的概率，熒光壽命因此延長。

4 結(jié) 論

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)合理論計(jì)算的方法，研究了溶劑對核黃素穩(wěn)態(tài)吸光譜、熒光光譜及時(shí)間分辨熒光光譜的影響。 應(yīng)用密度泛函理論，計(jì)算了核黃素分子間相互作用僅使P的峰強(qiáng)發(fā)生變 在三種溶劑中的理論吸收和發(fā)射光譜，并與實(shí)驗(yàn)測得光譜對比，吻合結(jié)果較好。 核黃素分子的電子激發(fā)及溶劑化作用影響分子偶極矩，從而導(dǎo)致吸收峰和熒光峰在不同溶劑中位移不同和熒光峰紅移； 并氫鍵供體溶劑中考慮分子間氫鍵作用的影響，氫鍵作用所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)提高核黃素分子的剛性，降低非輻射躍遷的幾率，熒光壽命延長。 該工作為研究其他黃素類物質(zhì)在溶劑環(huán)境中的光學(xué)性質(zhì)提供了思路。