郭 濤,紀(jì)冬梅,李艷平,盧 陽(yáng),弋 莉,王曉紅 (朝陽(yáng)市中心醫(yī)院血液內(nèi)科,遼寧 朝陽(yáng) 122000)

白血病以骨髓中造血干細(xì)胞無(wú)限增殖為特點(diǎn),除急性粒細(xì)胞和急性淋巴細(xì)胞白血病之外,慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)是最常見(jiàn)的白血病種類(lèi),是由粒細(xì)胞系造血干細(xì)胞的惡性增殖所致[1-4]。目前,CML的主要治療途徑是BCR/ABL融合蛋白靶向藥物聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑,但只在慢性期有效,對(duì)于急性期BCR/ABL融合蛋白陽(yáng)性病例療效欠佳[5-6]。此外,化療藥物通常缺乏腫瘤特異性,化療藥物或酪氨酸激酶抑制劑的長(zhǎng)期使用還會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性[7]。因此,探索新的CML治療方法對(duì)提高療效、減輕副作用具有重要意義。MicroRNAs(miR)是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA,存在于所有真核細(xì)胞中,長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸,參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡和遷移等過(guò)程,在機(jī)體中扮演著十分重要的角色。研究表明,miR的異常表達(dá)常與多種疾病發(fā)展進(jìn)程密切相關(guān),調(diào)控其表達(dá)在癌癥治療方面存在巨大潛力[8-9]。研究表明,miR-138-5p對(duì)人腎癌、胰腺癌和鼻咽癌等腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移及化療敏感性具有一定的調(diào)節(jié)作用[10-12]。但miR-138-5p在人白血病中的作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道，據(jù)報(bào)道,四砷四硫化物(As4S4)治療白血病的機(jī)制與下調(diào)miR-181密切相關(guān),而miR-138被證明對(duì)多種癌癥的生存和轉(zhuǎn)移具有抑制作用[10-13]。另外,HIF-1α的表達(dá)增加可加強(qiáng)腫瘤的化學(xué)抗輻射性,而通過(guò)RNA或小分子靶向抑制HIF-1α能抑制白血病細(xì)胞體內(nèi)外生長(zhǎng)[14-15]。故本研究以體外培養(yǎng)的人白血病K562細(xì)胞為研究對(duì)象,探討miR-138-5p對(duì)人白血病K562細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

人白血病K562細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司,實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)AB公司,電泳儀和半干轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司,Gel View 6000化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自廣州云星儀器有限公司,超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州中亞凈化設(shè)備有限公司,RPMI1640、胎牛血清及TurboFect Transfection Regent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自Thermo Fisher公司,熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司,RNA提取試劑盒和定量PCR試劑盒均購(gòu)自寶生物工程大連有限公司,抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;引物使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì),由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。miR-138 mimic、pc-HIF-1α及含HIF-1α野生型/突變型的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒載體均由上海Genepharm公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人白血病K562細(xì)胞,培養(yǎng)條件為37 ℃,5% CO2。每2～3 d換液1次,當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)80%時(shí)可進(jìn)行傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染

將K562細(xì)胞分為K562組、miR-138 mimic組、HIF-1α過(guò)表達(dá)組(pc-HIF-1α組)和共轉(zhuǎn)染組(mimic+pc-HIF-1α組)。嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū),將miR-138-5p mimic和pc-HIF-1α單獨(dú)或共轉(zhuǎn)染入K562細(xì)胞中,此外另設(shè)mimic-scramble組作為miR-138-5p mimic轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。

1.4 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū),將HIF-1α野生型/突變型載體或/和miR-138-5p mimic轉(zhuǎn)染入K562細(xì)胞中,培養(yǎng)48 h后,3 500 r/min離心2 min，小心吸棄培養(yǎng)基。PBS洗滌細(xì)胞后,再加入細(xì)胞裂解液,于室溫下振蕩5～10 min,收集并在3 000 r/min條件下離心5 min,取上清進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-138-5p和HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)水平

收集各組細(xì)胞,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū),提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)成cDNA,然后用引物進(jìn)行qRT-PCR。miR-138-5p引物,上游:5′-AGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCG-3′,下游:5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′;HIF-1α引物,上游:5′-TTGCTCATCAGTTGCCACTTCC-3′,下游:5′-AGCAATTCATCTGTGCTTTCATGTC-3′;GAPDH 引物,上游:5′-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3′,下游:5′-CAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè),用公式2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.6 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖

培養(yǎng)結(jié)束后,每孔加入10 μL CCK8溶液,繼續(xù)孵育4 h,采用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度。細(xì)胞生長(zhǎng)倍數(shù)=各組目標(biāo)時(shí)間吸光度/0 h吸光度。

1.7 Western blot檢測(cè)HIF-1α、Ki67、PCNA、VEGF、N-cadherin和E-cadherin蛋白的表達(dá)水平

收集各組細(xì)胞,經(jīng)PBS洗滌3次后,提取總蛋白,用BCA法定量蛋白,取等量變性后蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離,并轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜。然后用5%的牛血清蛋白(bull serum albumin,BSA)封閉1 h,再加入適當(dāng)稀釋濃度的一抗,4 ℃孵育過(guò)夜。第2天洗膜后加入適當(dāng)稀釋濃度的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗,室溫孵育1 h。滴加發(fā)光液曝光,于凝膠成像儀中拍照,并統(tǒng)計(jì)灰度值以計(jì)算相對(duì)蛋白表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-138-5p與HIF-1α的靶向關(guān)系

生物信息學(xué)結(jié)果顯示,miR-138-5p與HIF-1α的3′UTR端存在連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn),提示兩者可能存在靶向關(guān)系。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,結(jié)合位點(diǎn)突變前后,細(xì)胞熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但野生型HIF-1α質(zhì)粒與miR-138 mimic共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,K562細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.01),而突變型HIF-1α質(zhì)粒與miR-138-5p mimic共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,K562細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)明顯變化(P>0.05),見(jiàn)圖1。上述結(jié)果提示,miR-138-5p能靶向HIF-1α。

圖1 miR-138-5p靶向HIF-1α

2.2 miR-138對(duì)K562細(xì)胞HIF-1αmRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-138 mimic組miR-138-5pmRNA表達(dá)高于K562組,HIF-1α mRNA表達(dá)則低于K562組,差異具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而mimic-scramble組miR-138-5p和HIF-1α的mRNA表達(dá)水平與K562組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖2。上述結(jié)果提示,miR-138 mimic能下調(diào)HIF-1αmRNA在人白血病K562細(xì)胞中的表達(dá)水平。

2.3 miR-138對(duì)K562細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,miR-138 mimic組HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著低于K562組,而pc-HIF-1α組高于K562組,差異具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);同時(shí),mimic+pc-HIF-1α組HIF-1α蛋白表達(dá)少于pc-HIF-1α組,差異具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)圖3。上述結(jié)果提示,miR-138-5p mimic能下調(diào)人白血病K562細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)。

a:miR-138-5p mRNA相對(duì)表達(dá)量;b:qRT-PCR檢測(cè)K562細(xì)胞中HIF-1α mRNA相對(duì)表達(dá)量 *:與K562組比較,P<0.01

圖2 qRT-PCR檢測(cè)K562細(xì)胞中miR-138-5p和HIF-1α mRNA表達(dá)水平

a:Western blot檢測(cè)K562細(xì)胞中HIF-1蛋白表達(dá)的電泳圖;b:相對(duì)表達(dá)量分析 *:與K562組比較,P<0.01;#:與pc-HIF-1α組比較,P<0.01

圖3 Western blot檢測(cè)K562細(xì)胞中HIF-1α蛋白的表達(dá)

2.4 miR-138-5p靶向HIF-1α對(duì)K562細(xì)胞增殖影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-138 mimic組K562細(xì)胞增殖倍數(shù)低于K562組,差異具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);pc-HIF-1α組K562細(xì)胞增殖倍數(shù)高于K652組,差異具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);mimic+pc-HIF-1α組K562細(xì)胞增殖倍數(shù)低于pc-HIF-1α組,差異具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)圖4。上述結(jié)果提示,miR-138-5p靶向HIF-1α對(duì)人白血病K562細(xì)胞增殖能力有抑制作用。

*:與K562組比較,P<0.01;#:與pc-HIF-1α組比較,P<0.01

圖4 CCK-8法檢測(cè)K562細(xì)胞增殖

2.5 miR-138-5p靶向HIF-1α對(duì)K562細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-138 mimic組侵襲細(xì)胞數(shù)量少于K562組,差異具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);pc-HIF-1α組侵襲細(xì)胞數(shù)量多于K562組,差異具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);mimic+pc-HIF-1α組侵襲細(xì)胞數(shù)量少于pc-HIF-1α組,差異具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)圖5。上述結(jié)果提示,miR-138-5p靶向HIF-1α對(duì)人白血病K562細(xì)胞侵襲能力有抑制作用。

2.6 miR-138-5p靶向HIF-1α對(duì)K562細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示:miR-138 mimic組劃痕閉合率低于K562組,差異具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而pc-HIF-1α組劃痕閉合率高于K562組,差異具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);mimic+pc-HIF-1α組劃痕閉合率低于pc-HIF-1α組,差異具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)圖6。上述結(jié)果提示,miR-138-5p靶向HIF-1α對(duì)人白血病K562細(xì)胞遷移能力有抑制作用。

a:Transwell檢測(cè)K562細(xì)胞侵襲能力(結(jié)晶紫染色×400);b:Transwell定量分析 *:與K562組比較,P<0.01;#:與pc-HIF-1α組比較,P<0.01

圖5 Transwell檢測(cè)K562細(xì)胞侵襲能力

a:劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)K562細(xì)胞遷移能力(×200);b:劃痕實(shí)驗(yàn)定量分析 *:與K562組比較,P<0.01;#:與pc-HIF-1α組比較,P<0.01

2.7 miR-138-5p靶向HIF-1α對(duì)K562細(xì)胞增殖和EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，miR-138 mimic組增殖蛋白(Ki67、PCNA)、遷移標(biāo)記蛋白(VEGF)和間質(zhì)標(biāo)記蛋白(N-cadherin)表達(dá)低于K562組,而上皮標(biāo)記蛋白(E-cadherin)表達(dá)高于K562組,差異均具有極顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);pc-HIF-1α組則正好相反(P<0.01)。mimic+pc-HIF-1α組Ki67、PCNA、VEGF和N-cadherin表達(dá)低于pc-HIF-1α組(P<0.01),E-cadherin蛋白表達(dá)高于pc-HIF-1α組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖7。以上結(jié)果說(shuō)明,miR-138-5p靶向HIF-1α可降低人白血病K562細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。

3 討論

miR在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,參與調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等,被認(rèn)為是癌癥靶向治療的潛在作用靶點(diǎn)。尋找合適的靶點(diǎn)對(duì)癌癥的靶向治療具有重要作用,在針對(duì)腫瘤細(xì)胞起作用的同時(shí)減少機(jī)體毒副作用是靶向藥物實(shí)現(xiàn)理想療效的重要目標(biāo)。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)人白血病K562細(xì)胞,旨在探討miR-138-5p與HIF-1α的靶向關(guān)系及其對(duì)人白血病K562細(xì)胞體外生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移特性的影響。

a:Western blot檢測(cè)K562細(xì)胞增殖能力;b:Western blot檢測(cè)K562細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力;c:Western blot檢測(cè)K562細(xì)胞增殖能力定量分析結(jié)果;d:Western blot檢測(cè)K562細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力定量分析結(jié)果 *:與K562組比較,P<0.01;#:與pc-HIF-1α組比較,P<0.01

圖7 Western blot檢測(cè)K562細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力

細(xì)胞異常增殖是腫瘤的一大特點(diǎn),miR在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖方面具有重要作用。Wang等[16]的研究發(fā)現(xiàn),miR-335在多種癌癥中發(fā)揮癌基因或腫瘤抑制因子作用,能靶向抑制BCL-WmRNA的表達(dá),從而降低透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌786-O和CaKi-1細(xì)胞的增殖和侵襲能力。miR-34a靶向HMGB1從而促進(jìn)急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡和抑制其自噬[17]。而Yu等[18]研究發(fā)現(xiàn),miR-138-5p靶向抑制FOXC1從而減弱胰腺癌細(xì)胞的增殖能力;此外,miR-138-5p靶向抑制程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed cell death ligand 1,PD-L1)可降低人結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力[19]。本研究通過(guò)生物學(xué)預(yù)測(cè)miR-138-5p與HIF-1α存在連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn),并進(jìn)一步采用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。之后我們采用CCK-8法發(fā)現(xiàn),miR-138-5p靶向HIF-1α能顯著降低人白血病K562細(xì)胞的體外增殖能力。Western blot結(jié)果也證明,miR-138-5p靶向HIF-1α能有效抑制人白血病K562細(xì)胞中增殖關(guān)鍵蛋白Ki67和PCNA的蛋白水平,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)其體外生長(zhǎng)能力的抑制作用。

癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中至關(guān)重要,miR已被證明可調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。研究發(fā)現(xiàn),miR-141通過(guò)靶向調(diào)控促紅細(xì)胞生成素產(chǎn)生肝細(xì)胞受體A2的表達(dá)，從而抑制腎癌786-O和A498細(xì)胞侵襲[20];miR-155調(diào)節(jié)BRG1表達(dá)從而抑制多種人白血病和淋巴瘤DLBCL細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[21]。值得注意的是,miR-138-5p對(duì)膀胱癌細(xì)胞侵襲能力的調(diào)節(jié)作用是通過(guò)靶向凋亡抑制蛋白家族關(guān)鍵成員Survivin實(shí)現(xiàn)的,而靶向上皮細(xì)胞自我更新關(guān)鍵蛋白δNp63則是miR-138-5p抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞侵襲能力的機(jī)制[22-23]。本研究結(jié)果則發(fā)現(xiàn),miR-138-5p可通過(guò)靶向并抑制HIF-1α蛋白和mRNA表達(dá)水平,進(jìn)而減少體外培養(yǎng)的人白血病K562細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)量和劃痕閉合率,即降低K562細(xì)胞的體外侵襲轉(zhuǎn)移能力。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞獲得間質(zhì)特性從而增加細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的過(guò)程,是多種腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲的重要過(guò)程[24-25]。研究發(fā)現(xiàn),VEGF的表達(dá)水平與肺癌預(yù)后有一定的相關(guān)性,其高表達(dá)能促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[26]。E-cadherin是一種重要的細(xì)胞黏附因子,參與并介導(dǎo)細(xì)胞之間相互黏附,維持細(xì)胞間的黏附及組織完整性,相當(dāng)于一種抑癌因子,與多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān),其低表達(dá)或者表達(dá)缺失被認(rèn)為是腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟[27]。Xiao等[28]研究發(fā)現(xiàn),在小細(xì)胞肺癌中,miR-138-5p可靶向抑制Yes相關(guān)蛋白1,從而對(duì)細(xì)胞遷移起到抑制作用;Zhu等[29]研究發(fā)現(xiàn),在骨肉瘤細(xì)胞中,miR-138-5p可靶向抑制組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移能力的抑制和對(duì)順鉑的敏感性。本研究發(fā)現(xiàn),miR-138-5p靶向抑制HIF-1α表達(dá)同樣抑制了人白血病K562細(xì)胞的遷移能力,同時(shí)Western blot實(shí)驗(yàn)也證實(shí)K562細(xì)胞遷移能力的抑制與抑制間質(zhì)標(biāo)記蛋白、遷移標(biāo)記蛋白表達(dá)和促進(jìn)上皮標(biāo)記蛋白的表達(dá)水平相關(guān)。

綜上所述,在體外培養(yǎng)的人白血病K562細(xì)胞中,miR-138-5p靶向并抑制HIF-1α表達(dá)水平,從而對(duì)K562細(xì)胞體外增殖、侵襲和遷移能力產(chǎn)生抑制作用。本課題組下一步計(jì)劃建立人白血病移植瘤動(dòng)物模型,探討miR-138-5p對(duì)人白血病細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)和成瘤的影響,以期為白血病靶向治療提供參考。