姜麗艷，趙 博，王 智，陳啟瑞，李玥瑩，閆國棟

1.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130012

2.吉林大學(xué)分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130012

柚皮苷是一種天然的雙氫黃酮類化合物，藥理作用廣泛，具有抗過敏、抗炎、抗氧化、降血脂、抑癌、促進(jìn)骨細(xì)胞增殖和分化等多種生物活性[1]。ZAAT 等[2]發(fā)現(xiàn)，柚皮苷可以顯著延長小鼠的睡眠時(shí)間，說明柚皮苷具有鎮(zhèn)靜、安神的作用。另外的研究[3]發(fā)現(xiàn)，柚皮苷能促進(jìn)小鼠MC3T3-E1 細(xì)胞、小鼠原代培養(yǎng)成骨細(xì)胞、人原代培養(yǎng)成骨細(xì)胞和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等多種成骨細(xì)胞的增殖和分化。KANNO 等[4]發(fā)現(xiàn)柚皮苷可以顯著降低由岡田酸引起的細(xì)胞凋亡作用，而且對(duì)MCF-7、MDA-MB-231肺癌細(xì)胞，KATOIII、MKN-7 胃癌細(xì)胞，HepG2、Hep3B、Huh7 肺癌細(xì)胞，Hela、Hela-TG 子宮癌細(xì)胞，TNBC 乳腺癌細(xì)胞，PK-1 胰腺癌細(xì)胞，Caco-2 結(jié)腸癌細(xì)胞和HL-60、NALM-6、Jurkat、U937 白血病細(xì)胞的增殖都呈現(xiàn)一定的抑制作用[5]。但柚皮苷分子中存在多個(gè)酚羥基，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，脂溶性差，不易透過雙脂層細(xì)胞膜，難以到達(dá)靶向作用點(diǎn)而大大降低其應(yīng)有的生理活性[6]。

為了提高柚皮苷的穩(wěn)定性及其生理活性，一些物理化學(xué)方法[7]被用于改善柚皮苷的溶解性和利用度。研究報(bào)道利用非水相酶促催化技術(shù)對(duì)柚皮苷進(jìn)行衍生化的修飾研究，能夠提高柚皮苷的穩(wěn)定性，但催化體系的酶活不高，而且催化反應(yīng)的效率低[8]。微波輻射作為一種安全、綠色的加熱能源，已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于酶催化的各個(gè)領(lǐng)域[9]。本研究將非水相酶催化技術(shù)與微波能源偶聯(lián)應(yīng)用于乙?；制ぼ盏闹苽洌?yōu)化柚皮苷非水相酶促乙?；磻?yīng)過程，同時(shí)探索乙酰化柚皮苷對(duì)HepG2 細(xì)胞的抗增殖作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 微波輔助柚皮苷非水相酶促乙?；呋磻?yīng)

采用商業(yè)多功能微波反應(yīng)器（MCR-3 型，上海JieSi 微波化學(xué)公司）完成微波輔助催化。將反應(yīng)物（98%的柚皮苷，武漢福德化工有限公司）0.2 mmol、酰基供體4 mmol、有機(jī)溶劑20 mL 和黑曲霉固定化脂肪酶ANL（99%，丹麥Novo 公司）550 mg 置于磨口三角瓶中，旋轉(zhuǎn)攪拌磁板和磁力攪拌棒對(duì)反應(yīng)混合物進(jìn)行混合，控制不同的微波功率、微波設(shè)置溫度和微波條件下水活度（aw），監(jiān)控反應(yīng)混合物的溫度，反應(yīng)設(shè)定時(shí)間后取樣檢測，反應(yīng)結(jié)束時(shí)將酶過濾終止反應(yīng)，并將溶劑旋轉(zhuǎn)蒸干。所有的實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次（n=3）。

柚皮苷的非水相酶促乙?；磻?yīng)如下所示。

反應(yīng)進(jìn)程通過反相薄層色譜（RPTLC）和Waters 600 高效液相色譜（HPLC）檢測。RPTLC 分析時(shí)，樣品點(diǎn)在Kieselgel 60 RP-18 F254 板上，利用三氯甲烷/甲醇（體積比為3:1）展開劑展開，在UV 254 nm 下檢測柚皮苷及其衍生物的反應(yīng)進(jìn)程。HPLC 操作條件：Thermo C18（4.6 mm × 250 mm × 5 μm，Agilent，USA）色譜柱；流動(dòng)相是水（A）和甲醇（B），0～5 min 40%～80%(B)，5～15 min 維持80%(B)，15～25 min 80%～40%(B)；流速1.0 mL/min。柱溫30 °C，進(jìn)樣量為10 μL；檢測波長為330 nm，柚皮苷及其乙?；a(chǎn)物的保留時(shí)間分別為8.695 min 和10.474 min[10]。

1.2 水活度的設(shè)定

所有反應(yīng)試劑在133 Pa 真空條件下預(yù)干燥12 h，在反應(yīng)混合物中加入適量水維持一定的水活度。采用水活度測定儀（Aqualab 4TE/TEV，上海君翼儀器設(shè)備有限公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)測量。

圖1 VC 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of VC

1.3 柚皮苷及其酶促衍生物的體外抗氧化作用

（1）總抗氧化能力的測定-鉬酸銨法[11]

分別配制0.1 mg/mL 的柚皮苷和乙?；制ぼ昭苌锏膬煞N溶液，和0.01～0.09 mg/mL 的維生素C（VC）溶液，將0.3 mL 待測物加入到3 mL 的鉬酸銨中，將混合液混勻并于95 ℃恒溫水浴90 min，反應(yīng)液冷卻后，于695 nm 處測定吸光值，總抗氧化能力VC與吸收強(qiáng)度A695的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

（2）鐵離子還原能力的測定-FRAP 法[12]

分別配制0.05 mg/mL 樣品溶液，2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）（無水乙醇）和VC溶液（超純水）三種溶液，于10 mL 試管中加入一定量的待測物，再加入2 mL 鐵離子還原能力（FRAP）工作液，振蕩搖勻，37 ℃下靜置10 min，測定593 nm 處吸光值。

1.4 親脂性實(shí)驗(yàn)

采用油水分配系數(shù)方法檢測柚皮苷和乙?；制ぼ盏挠H脂性[13]。在500 mL 的磨口錐形試劑瓶中加入等體積的正辛醇和去離子水，30 °C 下恒溫振蕩24 h，然后于分液漏斗中室溫靜置24 h，實(shí)驗(yàn)時(shí)取上層辛醇相和下層水相作為飽和溶劑。稱取柚皮苷或乙?；a(chǎn)物1 mg，溶于5 mL 的預(yù)飽和正辛醇溶液，混合均勻，作為樣品貯備液。取0.6 mL 樣品貯備液，加入4.4 mL 預(yù)飽和正辛醇溶液，測定其280 nm 處的吸光度值為（A0），再加入預(yù)飽和的水溶液，旋渦震蕩1 min 后室溫靜置24 h，測其上層正辛醇相的吸光度值為（Ax）。計(jì)算正辛醇/水分配系數(shù)logP：logP=logAx/(A0-Ax)。

1.5 檢測HepG2 細(xì)胞的抗增殖作用[14]

取對(duì)數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）至離心管內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞的濃度為5×104個(gè)細(xì)胞/mL，每孔100 μL 接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，保證細(xì)胞狀態(tài)良好，貼壁正常；用完全培養(yǎng)基配制柚皮苷及其衍生物母液，過濾除菌，再分別稀釋，藥物作用72 h，每一個(gè)實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置三個(gè)重復(fù)孔；藥物作用結(jié)束后，無菌條件下加入20 μL 的噻唑藍(lán)（MTT）溶液，在5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h；加入0.15 mL 的二甲基亞砜（DMSO）溶解產(chǎn)生的藍(lán)紫色晶體，在492 nm 波長條件下測定光吸收值即OD 實(shí)驗(yàn)值，純HepG2 細(xì)胞的吸光度值為OD 對(duì)照值。IC50為抑制率50%時(shí)的藥物濃度。

計(jì)算細(xì)胞抑制率(%)=（1-OD 實(shí)驗(yàn)值/OD 對(duì)照值）×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 微波輔助柚皮苷酶促乙?；磻?yīng)條件優(yōu)化

2.1.1 微波功率對(duì)柚皮苷非水相酶促乙酰化反應(yīng)的影響

在水活度為0.60、微波設(shè)置溫度為40 ℃的條件下，不同微波功率下柚皮苷非水相酶促乙酰化反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。從圖2 可以看出，當(dāng)微波功率從100 W 逐漸增加時(shí)，柚皮苷酶促乙酰化反應(yīng)的酶活開始增加，當(dāng)微波功率為400 W 時(shí)，酶活達(dá)到最高，為(306±5) μmol/(h·g)；如果繼續(xù)增加微波功率，酶活卻明顯下降。這可能是因?yàn)榇蠊β实奈⒉ㄖ率姑傅鞍椎倪^度裸露，從而引起酶結(jié)構(gòu)過于松散，破壞酶的立體構(gòu)象，導(dǎo)致脂肪酶ANL 的失活[15]。400 W 為本實(shí)驗(yàn)的微波最佳功率。

圖2 微波功率對(duì)ANL 酶活度的影響Fig.2 Effect of microwave power on ANL enzyme activity

圖3 微波溫度對(duì)對(duì)ANL 酶活度的影響Fig.3 Effect of microwave temperature on ANL enzyme activity

2.1.2 微波溫度對(duì)柚皮苷非水相酶促乙?；磻?yīng)的影響

同樣地，固定微波功率為400 W，水活度為0.60 的條件，考察了不同微波溫度（由微波處理時(shí)間）時(shí)脂肪酶ANL 催化柚皮苷乙?；姆磻?yīng)，結(jié)果如圖3 所示。圖3 顯示當(dāng)微波溫度從30 ℃逐漸升高到70 ℃時(shí)，ANL 酶活逐漸增加，且在70 ℃時(shí)酶活達(dá)到最大值，為(460±6) μmol/(h·g)，但當(dāng)溫度從70 ℃繼續(xù)升高到90 ℃時(shí)，酶活卻呈明顯下降趨勢。因?yàn)楫?dāng)溫度在一定范圍內(nèi)逐漸升高時(shí)，增加了酶分子之間的接觸機(jī)會(huì)，進(jìn)而使酶活提高；但當(dāng)溫度過高時(shí)，破壞了酶分子的原有構(gòu)象，導(dǎo)致酶活降低[16]。70 ℃為本實(shí)驗(yàn)的最適微波溫度。

2.1.3 水活度對(duì)柚皮苷非水相酶促乙?；磻?yīng)的影響

在微波功率位400 W、微波溫度為70 ℃的條件下，考察了不同水活度（aw）下的柚皮苷酶促乙?；磻?yīng)，結(jié)果如圖4 所示。從圖4 可以發(fā)現(xiàn)，隨著aw的不斷增加，柚皮苷酶促乙?；磻?yīng)的酶活也逐漸增加，且在aw為0.80 時(shí)酶活性達(dá)到最大值，為(612±10) μmol/(h·g)；但當(dāng)aw繼續(xù)增加時(shí)，酶活性呈明顯下降趨勢。所以，aw為0.80 是ANL 催化柚皮苷乙?；磻?yīng)的最適水活度。

圖4 水活度對(duì)ANL 酶活度的影響Fig.4 Effect of water activity on ANL enzyme activity

圖5 微波加熱處理下脂肪酶ANL 的穩(wěn)定性Fig.5 Reusability of ANL under microwave irradiation

2.1.4 微波加熱處理下脂肪酶ANL 的穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)考察了微波加熱條件下脂肪酶ANL 被回收重復(fù)使用的活性，即ANL 活性的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5 所示。圖5 結(jié)果表明，在微波功率為400 W，加熱溫度為70 ℃，aw為0.80 的條件下，脂肪酶ANL反復(fù)使用十個(gè)反應(yīng)周期后，活性下降的并不明顯，表明在此功率微波輻射下，脂肪酶ANL 具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

2.2 柚皮苷及其酶促衍生物的結(jié)構(gòu)鑒定

利用RPTLC 和HPLC 監(jiān)測柚皮苷非水相乙?；磻?yīng)過程，發(fā)現(xiàn)2 h內(nèi)的轉(zhuǎn)化率為（90.42±2.43）%，說明該催化反應(yīng)進(jìn)行較好。經(jīng)核磁共振譜儀（AC500，Bruker）1H 和13C 對(duì)產(chǎn)物檢測，結(jié)果如下：

1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 12.06 (d, 1H), 9.64 (s, 1H), 7.33 (d, 2H), 6.81 (s, 2H), 6.12 (d, 1H), 6.07(d, 1H), 5.55-5.41 (m, 3H), 5.18 (dd, 1H), 5.10 (d, 1H), 4.74 (d, 2H), 4.27 (d, 1H), 4.04 (dd, 1H), 3.76-3.67(m, 3H), 3.49 (d, 2H), 3.36 (s, 3H), 3.23-3.15 (m, 2H), 2.72 (dd, 1H), 1.92 (s, 3H), 1.24 (s, 3H)。

13C NMR (500 MHz, DMSO) 18.5, 42.6, 63.7, 68.8, 70.4, 70.8, 70.9, 72.3, 74.1, 77.4, 79.3, 95.7, 96.8,97.7, 101.0, 103.8, 115.6(2C), 128.9, 129.0, 129.1, 158.3, 163.3, 165.0, 170.6, 197.8。

表明柚皮苷非水相乙?；磻?yīng)的衍生物為6′-乙?；制ぼ铡？梢夾NL 酶催化柚皮苷乙酰化反應(yīng)具有高度的位置選擇特異性。

2.3 柚皮苷及其酶促衍生物的體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 柚皮苷及其6′-乙酰化柚皮苷的總抗氧化能力總抗氧化能力（TAC）的測定運(yùn)用的是鉬酸銨法，即抗氧化物質(zhì)可以將Mo（Ⅵ）還原為Mo（Ⅴ），并且在酸性條件下形成綠色Mo（Ⅴ）的磷酸鹽。根據(jù)Vc 曲線（圖1）可確定濃度為0.1 mg/mL 時(shí)，每mg 樣品的總抗氧化能力柚皮苷為（0.036±0.00193） mg-VC/mg，6′-乙?；制ぼ諡椋?.033±0.00169）mg-VC/mg。表明柚皮苷及6′-乙酰化柚皮苷具有較強(qiáng)的總抗氧化能力，6′-乙酰化皮苷的總抗氧化能力較母體略有下降。分析原因可能是多酚類化合物的總抗氧化能力根源于其多酚羥基的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，6′-乙酰化柚皮苷是柚皮苷果糖C-6′的羥基被乙?；娲肿咏Y(jié)構(gòu)中少了一個(gè)羥基，所以6′-乙酰化柚皮苷的體外總抗氧化能力略下降。

2.3.2 柚皮苷及其6′-乙酰化柚皮苷的鐵離子還原能力

在低pH 的溶液中，有抗氧化劑存在時(shí)，F(xiàn)e3+-三吡啶三嗪（Fe3+-TPTZ）被還原成Fe2+-三吡啶三嗪（Fe2+-TPTZ），反應(yīng)液則變成深藍(lán)色，在593 nm 處有最大吸收，吸光度愈高表示還原能力也越強(qiáng)。圖6所示為柚皮苷及其6′-乙?；制ぼ杖芤旱奈舛??？芍S著樣品濃度的增加，吸光度值逐漸升高，即鐵離子的還原能力逐漸升高。柚皮苷的鐵離子還原能力很強(qiáng)，與VC相近；與柚皮苷母體相比，6′-乙?；制ぼ盏蔫F離子還原能力略下降。

圖6 不同濃度柚皮苷、6′-乙?；制ぼ蘸蚔C 的鐵離子還原能力Fig.6 Dose-dependent ferric reducing ability of naringin,6′-acetylated naringin and VC

2.4 柚皮苷及其酶促衍生物的親酯性能

利用正辛醇/水的分配系數(shù)（logP）對(duì)柚皮苷及其乙酰化產(chǎn)物的親油性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1（logP 的值越高表明該化合物的親油性越高）。

表1 柚皮苷及其乙?；a(chǎn)物的正辛醇/水分配系數(shù)結(jié)果(25 °C)Table 1 Results of the Octanol/water partition coefficient of naringin and its acetylated derivative

由表1 可以看出，柚皮苷的乙?；a(chǎn)物和柚皮苷底物相比顯示了較高的親油性，親酯能力比底物提高了大約65%。這可能是因?yàn)殍制ぼ盏墓? 位-羥基被乙酰基取代，提高了乙?；a(chǎn)物的親油性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可以通過柚皮苷及其乙?；a(chǎn)物的在HPLC 的出峰時(shí)間觀察到，柚皮苷的乙?；a(chǎn)物出峰時(shí)間要遠(yuǎn)大于柚皮苷。柚皮苷乙酰化產(chǎn)物親油性的提高，增加了其進(jìn)入磷脂雙分子層細(xì)胞膜的機(jī)會(huì)，及有可能增強(qiáng)其體內(nèi)細(xì)胞活性。

2.5 柚皮苷及其酶促衍生物對(duì)HepG2 細(xì)胞抗增殖性能

圖7 柚皮苷對(duì)HepG2 細(xì)胞抗增殖的影響Fig.7 The inhibitory effects of naringin on HepG2 cell viability

當(dāng)使用柚皮苷及其酶促乙?；苌飳?duì)HepG2 細(xì)胞作用72 h 后，不同濃度的柚皮苷及其酶促乙酰化衍生物對(duì)HepG2 細(xì)胞呈現(xiàn)不同趨勢的生長增殖抑制作用，結(jié)果見圖7。可以看到，隨著柚皮苷及其酶促乙?；苌餄舛鹊牟粩嘣黾?，對(duì)HepG2 細(xì)胞的生長增殖抑制作用逐漸加強(qiáng)。當(dāng)柚皮苷及乙?；制ぼ諠舛仁褂脼?.0 mmol/L 時(shí)，乙?；制ぼ諏?duì)HepG2 細(xì)胞的生長增殖抑制率為80%（細(xì)胞生長增殖顯著程度p 小于0.05），IC50值為0.825 mmol/L，而柚皮苷對(duì)HepG2 細(xì)胞的生長增殖抑制率僅為48%，IC50值為1.35 mmol/L，乙?；制ぼ蛰^母體柚皮苷相比表現(xiàn)了更好的HepG2 細(xì)胞生長增殖抑制作用。

3 結(jié) 論

微波輔助技術(shù)成功催化了柚皮苷的非水相酶促乙?；磻?yīng)，在微波功率為400 W，微波溫度為70 ℃，水活度為0.80 時(shí)反應(yīng)的脂肪酶ANL 最高酶活為(612±10) μmol/(h·g)，比傳統(tǒng)方法提高4 倍左右。不僅提高了非水相反應(yīng)的反應(yīng)速率，而且提高了酶的位置選擇性。分析認(rèn)為微波輻射和酶催化偶聯(lián)時(shí)能夠顯著提高酶的作用環(huán)境，影響酶活性中心和底物的誘導(dǎo)及契合作用，增加底物的反應(yīng)基團(tuán)和酶的活性位點(diǎn)結(jié)合機(jī)會(huì)，進(jìn)而提高了反應(yīng)體系的反應(yīng)速度，增強(qiáng)了酶的催化專一性。雖然乙?；制ぼ蛰^柚皮苷母體相比體外抗氧化性略降低，但乙?；制ぼ盏挠H脂性有所提高，可能會(huì)增加其進(jìn)入磷脂雙分子層細(xì)胞膜的機(jī)會(huì)，進(jìn)而對(duì)HepG2 細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗增殖能力。