林育能，何新榮，姚 意，徐佳興，鐘義富，陳德暉

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 兒科，廣東 廣州 510120;2.中山大學(xué)腫瘤防治中心 重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510060;3.中山大學(xué)腫瘤防治中心 檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510060)

急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)是各種病因?qū)е碌募毙苑螕p傷(Acute lung injury,ALI)[1]，是ICU最主要的死亡因素之一[2]。不少研究報(bào)道ARDS/ALI存在肺泡凋亡現(xiàn)象[3-4]。還原型谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH)，在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的作用下，能與過氧化物及自由基相結(jié)合，保護(hù)細(xì)胞膜中含巰基的蛋白質(zhì)和含巰基的酶不被破壞[5]，調(diào)節(jié)凋亡作用[6]。目前有關(guān)GSH對(duì)ARDS/ALI 肺泡凋亡的研究尚少。本研究擬在脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)ARDS/ ALI的動(dòng)物模型上，觀察補(bǔ)充GSH對(duì)ARDS/ALI模型炎癥損傷和肺泡細(xì)胞凋亡的變化，探討GSH對(duì)內(nèi)毒性ALI的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立 本研究方案由廣州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)是按照學(xué)校有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的要求進(jìn)行的。實(shí)驗(yàn)使用了40只2～3個(gè)月齡的清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠(體重300 g左右)，按照隨機(jī)數(shù)納入為偽模型組(n=10)、ALI模型組(n=15)和GSH干預(yù)組(n=15)。實(shí)驗(yàn)前1d將動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，保持標(biāo)準(zhǔn)飲食和隨意飲水。實(shí)驗(yàn)時(shí)，先用鹽酸氯胺酮(60 mg/kg)肌肉注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上行吸入式氣管滴注LPS溶液0.2 mL(3 mg/kg,Escherchia Coli O111:B4，Sigma公司，美國)建立ALI模型。然后術(shù)后皮下注射生理鹽水(20 mL/kg)防止血容量不足。干預(yù)組在給予LPS后2h后，給予液體復(fù)蘇的同時(shí)從尾靜脈注入還原型谷胱甘肽溶液1 mL(0.3g/kg，重慶藥友制藥有限公司)。模型組和偽模型組給予等量的生理鹽水。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，于注射 LPS后6 h后使用戊巴比妥處死大鼠。

1.2 標(biāo)本的采集與檢測 處死大鼠時(shí)，通過心臟左心室穿刺采集大鼠的血液樣品，使用GEM 3000血?dú)夥治鰞x作血?dú)夥治觯?XN9000全自動(dòng)血液學(xué)分析儀進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，將血液離心收集上清液用于分析血漿中的炎癥因子白介素6(IL-6)。

動(dòng)物處死后結(jié)扎左支氣管，收集支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)。BALF蛋白質(zhì)含量使用商業(yè)試劑盒采用考馬斯亮蘭法檢測(南京建成生物工程研究所)，用于評(píng)價(jià)肺損傷的血管滲出性。血漿和BALF的IL-6濃度的測定均采用大鼠IL-6酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)進(jìn)行檢測。BALF中可溶性凋亡相關(guān)因子配體(sFasL)濃度使用大鼠sFasL ELISA試劑盒(上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司)檢測。將BALF離心沉淀重新混懸后作瑞氏染色，進(jìn)行多形核中性粒細(xì)胞(PMN)計(jì)數(shù)。將沉淀用碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色法，F(xiàn)ACSCAN流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，在分析PI熒光的直方圖時(shí)，先用門技術(shù)排除成雙或聚集的細(xì)胞以及發(fā)微弱熒光的細(xì)胞碎片，在G1/G0期前出現(xiàn)一亞二倍體峰(subG1)為細(xì)胞凋亡峰，以subG1占二倍體(G1/G0)的百分率計(jì)算細(xì)胞凋亡率。通過計(jì)算右肺葉組織的濕/干比評(píng)估肺組織滲出和水腫程度。取左肺葉勻漿上清液并使用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定肺的丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量，用于評(píng)估肺泡細(xì)胞損傷程度。

2 結(jié)果

2.1 血?dú)夥治?偽模型組大鼠在6 h觀察期間，呼吸平順。ALI模型組和GSH干預(yù)組的動(dòng)物出現(xiàn)進(jìn)行性加重的呼吸急促，與偽模型組對(duì)比，兩組的血?dú)夥治鼍憩F(xiàn)出氧分壓下降，二氧化碳分壓升高，肺的氧合指數(shù)降低(P<0.05)。但GSH干預(yù)組的氧合能力較ALI模型組顯著改善(P<0.05，見表1)。

表1 3組動(dòng)物血?dú)夥治鼋Y(jié)果

組別例數(shù)pH氧分壓(mmHg)二氧化碳分壓(mmHg)氧合指數(shù)偽模型107.33±0.04 89.8±3.5 44.2±2.3427.8±16.8ALI模型157.03±0.16#42.2±4.5# 59.2±11.3#198.3±25.5#GSH干預(yù)157.11±0.09#※46.7±4.0#※53.1±7.6 220.6±22.2#※F21.40466.14 9.50360.05P<0.05<0.05<0.05<0.05

#：與偽模型組比較P<0.05；※：與ALI模型組比較P<0.05，1 mmHg=0.133 28 kPa。

2.2 白細(xì)胞計(jì)數(shù)與IL-6含量 與偽模型組對(duì)比，ALI模型組與GSH干預(yù)組動(dòng)物血液和BALF的粒細(xì)胞計(jì)數(shù)以及IL-6濃度顯著升高(P<0.05)。GSH干預(yù)組的白細(xì)胞和PMN計(jì)數(shù)與比ALI模型組比較，無顯著性差異(P>0.05)。GSH干預(yù)組的IL-6濃度卻顯著低于ALI模型組(P<0.05，見表2)。

表2 3組動(dòng)物白細(xì)胞計(jì)數(shù)與IL-6含量

組別例數(shù)血液白細(xì)胞計(jì)數(shù)(×109/L)中性粒細(xì)胞(×109/L)IL-6(pg/mL)BALF中性粒細(xì)胞(×109/L)IL-6(pg/mL)偽模型107.6±2.21.5±0.670±151.8±0.394±14ALI模型1521.2±3.6#7.6±0.8#328±32#8.2±1.0#425±29#GSH干預(yù)1519.9±4.2#7.2±1.0#308±27#※7.6±1.2#388±45#※F50.71173.10329.72147.64328.51P<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

#：與偽模型組比較P<0.05；※：與ALI模型組比較P<0.05。

2.3 BALF蛋白與肺組織MDA含量 ALI模型組與GSH干預(yù)組的BALP的蛋白含量比偽模型組明顯升高(P<0.05)，但GSH試驗(yàn)組要顯著低于ALI模型組(P<0.05)。同樣地，干預(yù)組肺組織的MDA含量雖然比偽模型組高，但要低于模型組(P<0.05，見表3)。

表3 3組動(dòng)物BALP蛋白與肺組織MDA含量

組別例數(shù)蛋白(g/L)MDA(nmol/mg prot)偽模型100.90±0.09 1.34±0.10 ALI模型151.97±0.20#2.56±0.31#GSH干預(yù)151.65±0.21#※2.24±0.29#※F107.3364.22P<0.05<0.05

#：與偽模型組比較P<0.05；※：與ALI模型組比較P<0.05。

2.4 BALF的sFasL濃度與細(xì)胞凋亡率 3組BALF的sFasL含量有顯著性差異(F=133.47，P<0.05)。ALI模型組與GSH干預(yù)組BALF的sFasL含量均明顯高于偽模型組(P<0.05)。但干預(yù)組的sFasL含量顯著低于ALI模型組(P=0.023，圖1A)。流式細(xì)胞儀檢測的結(jié)果顯示，3組的細(xì)胞凋亡率也有顯著性差異(F=56.38，P<0.05)，與ALI模型組比較，GSH能降低細(xì)胞的凋亡率(P=0.016，見圖1B)。

2.5 肺組織濕/干比 3組大鼠的肺組織濕/干比有顯著性差異(F=18.43，P<0.05)。偽模型組大鼠肺的濕/干比為3.83±0.62。ALI模型組和GSH干預(yù)組分別為6.83±1.46和5.57±1.22，均明顯高于偽模型組(P<0.05)，但GSH干預(yù)組的濕/干比顯著低于ALI模型組(P<0.05)。

圖1 3組動(dòng)物BALF的sFasL濃度和細(xì)胞凋亡率

3 討論

在本研究中，給予LPS可以誘發(fā)大鼠明顯的肺部炎癥和ALI，表現(xiàn)出明顯的低氧血癥。給予GSH后，BALF的中性粒細(xì)胞沒有顯著減少，提示GSH并不能阻止LPS引起的炎癥細(xì)胞的浸潤，但是能抑制炎癥介質(zhì)IL-6的產(chǎn)生。與模型對(duì)照組比較，谷胱甘肽組動(dòng)物BALF的蛋白滲出減少，肺組織過氧化損傷的產(chǎn)物MDA含量也顯著減少，肺的濕/干比降低，都說明了GSH有助于減輕LPS誘導(dǎo)的肺損傷，從而使得肺的氧合得到改善。在失血性休克或腹膜炎大鼠模型上有研究也發(fā)現(xiàn)GSH有類似的保護(hù)作用[7-8]。

不少研究發(fā)現(xiàn)ARDS存在肺泡細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。Martin發(fā)現(xiàn)[3]，ARDS患者BALF中的sFasL含量超過健康人，當(dāng)在體外培養(yǎng)的支氣管肺泡上皮細(xì)胞中加入LPS后，sFasL的釋放成倍增加。Satoru[4]發(fā)現(xiàn)在ARDS發(fā)病24h內(nèi)，患者肺泡灌洗液中的sFasL含量最為明顯。我們的研究結(jié)果顯示，ARDS/ALI大鼠的BALF中的sFasL顯著升高，并且BALF中凋亡細(xì)胞明顯增多。給予GSH處理后，ALI/ARDS大鼠BALF的sFasL含量和細(xì)胞凋亡率均顯著降低，這說明通過Fas/FasL途徑介導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡應(yīng)該是GSH減輕肺損傷的一個(gè)重要機(jī)制。

由于是探索性研究，本研究存在一些不足之處。首先，考慮到肺泡灌洗的影響和ARDS肺部改變的不均一性特點(diǎn)，沒有做肺部形態(tài)學(xué)的病理檢測；其次，沒有直接檢測肺組織Fas/FasL的mRNA表達(dá)的改變；第三，沒有探討GSH影響Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡通路的機(jī)制，這也正是本研究下一步的研究方向。