張濤濤

（三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 三門峽 472000）

杜仲（Eucommia ulmoides）為杜仲科杜仲屬藥食兩用植物，富含黃酮、多糖、槲皮素、杜仲膠和多種維生素[1,2]，因其具有補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨等功效，已被加工制成各類食品或藥品使用[3]。近來有研究發(fā)現(xiàn)，其樹皮中多糖具有抗氧化、降血糖和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等活性[4-6]，特別是王一民等提取出該植物的樹皮多糖，發(fā)現(xiàn)可較好改善運(yùn)動性疲勞[7]，然而該提取物中仍含有較多的鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，致使多糖含量偏低，可能影響產(chǎn)物的功效。

大孔樹脂的吸附分離技術(shù)同時具有機(jī)械篩分與化學(xué)吸附的特點(diǎn)，選擇性高，干擾因素少，且可重復(fù)循環(huán)利用，被廣泛用于天然產(chǎn)物的活性成分分離與純化[8,9]，由于目前對于杜仲多糖提取物的純化研究鮮有報(bào)道，因此，本研究在杜仲樹皮的多糖提取研究基礎(chǔ)上，探討大孔樹脂純化其提取物的最佳工藝條件，同時考察不同產(chǎn)物的抗疲勞作用效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

杜仲采購于河南禹州中藥材市場，經(jīng)鑒定為杜仲科植物杜仲的干燥樹皮；葡萄糖（定量分析用，中國藥品生物制品檢定所）；乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、硫酸、氫氧化鈉均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

721型紫外-可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；ME104型電子天平（梅特勒-托利多公司）；DWT-B02型多功能粉碎機(jī)（河南耕暉機(jī)械設(shè)備有限公司）；PR-2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（普瑞科技有限公司）；VFD-1000A型冷凍干燥箱（上海舜制儀器制造有限公司）；ZWY-110X50型恒溫振蕩器（北京海天友誠科技有限公司）；AB-8、D-101型大孔樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；NKA-9、HPD 600、DM 130型大孔樹脂（天津西金納環(huán)保材料科技有限公司）。

乳酸 (BLA)檢測試劑盒、乳酸脫氫酶 (LDH)檢測試劑（南京信帆生物有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取物制備 杜仲樹皮粉碎完全后，過40目篩，加入80%乙醇溶液浸泡后過濾，濾渣經(jīng)80°C水回流 2 次(料液比：1∶15)，每次 2h，合并濾液，減壓濃縮，加入乙醇沉淀離心，即得杜仲多糖粗提物[10]。

1.3.2 樹脂靜態(tài)吸附考察 依照文獻(xiàn)測定方法[11,12]，準(zhǔn)確稱取5.0g經(jīng)活化處理后的大孔樹脂（D-101、DM-130、AB-8、NKA-9、HPD 600） 置于錐形瓶內(nèi)，分別加入體積為50mL 5.1mg·mL-1提取液，靜態(tài)吸附24h后過濾，所得飽和吸附后的樹脂置于150 mL 70%乙醇內(nèi)，靜態(tài)洗脫24h，分別測得不同類型樹脂對杜仲多糖的靜態(tài)飽和吸附量、吸附率、洗脫率及回收率。

1.3.3 動態(tài)吸附與洗脫考察 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以50mL無水乙醇為溶劑，分別考察提取液的濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg·mL-1）、pH 值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）和流速（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL·min-1）對樹脂的吸附率影響；同時分別考察洗脫液乙醇的濃度（50、60、70、80、90%）、流速（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL·min-1）及體積（100、120、140、160、180mL）對樹脂的解吸率影響。

1.3.4 多糖定量分析 精密稱取干燥恒重的葡萄糖對照品30mg，置于100mL容量瓶內(nèi)，加水稀釋至刻度后，分別精密移取 1、2、3、5、10mL 至 100mL 容量瓶中，另加入10mL 5%苯酚溶液和5.0mL濃硫酸后，以水定容至刻度線搖勻，置于40℃水浴加熱15min后，冷卻至室溫，以水作空白，于480nm波長處測定吸光度值[13]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=1.1325C+0.017（r=0.9986）。

精密移取樣品溶液1mL，置于20mL容量瓶中，分別加入10mL濃硫酸與2.0mL 5%苯酚溶液后，以水定容至刻度線搖勻，測得樣品吸光度值。

1.3.5 抗疲勞作用效果

1.3.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 60只健康雄性小鼠，隨機(jī)平均分為3組，分別標(biāo)記為對照組、提取組和純化組，其中對照組正常喂食，而提取組和純化組的喂養(yǎng)飼料內(nèi)分別摻入等量的提取物和純化物，每天喂食2次，連續(xù)喂食30d[14]。

1.3.5.2 負(fù)重游泳時間 每組隨機(jī)抽取10只，于鼠尾負(fù)重自身5%的重物，進(jìn)行力竭性游泳試驗(yàn)，記錄小鼠自入水開始游泳至沉沒超過10s的時間[15]。

1.3.5.3 乳酸生化指標(biāo)檢測 動物游泳10min后，收集血清，利用試劑盒，分別測得不同組別小鼠血清中的乳酸濃度及乳酸脫氫酶活力[16]。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 19.0對動物試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)p＜0.05表示具有顯著性差異，p＜0.01表示具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹脂型號選擇

表1為不同型號樹脂的靜態(tài)吸附與洗脫性能比較。

表1 不同樹脂的靜態(tài)吸附與洗脫性能比較Tab.1 Comparison of static adsorption and desorption performance of different type resins

從表1可知，弱極性樹脂表現(xiàn)較好的吸附與洗脫性能，其中AB-8大孔樹脂的回收率高于其它4類樹脂，達(dá)到85.73%，因此，確定采用AB-8大孔樹脂純化杜仲多糖提取物。

2.2 動態(tài)吸附與洗脫條件考察

2.2.1 提取液濃度影響 分別考察不同杜仲多糖提取液的質(zhì)量濃度對樹脂的吸附率影響，結(jié)果見圖1。

圖1 提取液濃度對吸附率的影響Fig.1 Effect of extract solution concentration on adsorption rate

伴隨提取液濃度的增大，樹脂的吸附率先增高后降低，當(dāng)濃度為0.6mg·mL-1時，吸附率達(dá)到最大，因此選擇 0.5、0.6、0.7mg·mL-1作為正交試驗(yàn)中提取液濃度的考察水平。

2.2.2 上柱液pH值影響 不同提取液pH值對吸附率的影響，見圖2。

圖2 提取液pH值對吸附率的影響Fig.2 Effect of loading solution pH on adsorption rate

隨著提取液pH值的增大，樹脂的吸附率先增高后降低，當(dāng)pH值為6.0時達(dá)到最大，這可能由于在弱酸性環(huán)境下，杜仲多糖有利于保持分子形式，易于吸附，因此選擇5.0、6.0、7.0作為正交試驗(yàn)中提取液pH值的考察水平。

2.2.3 上樣流速影響 不同上樣流速對樹脂吸附率的影響，見圖3。

圖3 上樣流速對吸附率的影響Fig.3 Effect of loading solution flow rate on adsorption rate

從圖3可知，隨著上樣流速的增大，吸附率不斷下降，考慮兼顧吸附效率，因此選擇1.0、2.0、3.0mL·min-1作為正交試驗(yàn)中上樣流速的考察水平。

2.2.4 洗脫液濃度影響 不同濃度的乙醇對杜仲多糖的洗脫效果，見圖4。

圖4 洗脫液濃度對洗脫率的影響Fig.4 Effect of eluent concentration on desorption rate

由圖4可見，隨著洗脫液濃度增大，洗脫率逐漸升高，至70%開始下降。這可能歸因于乙醇濃度較低難以破壞多糖與樹脂形成的氫鍵，而濃度過高則與多糖的作用力降低，因此，選擇65%、70%、75%作為正交試驗(yàn)中乙醇溶液的濃度考察水平。

2.2.5 洗脫流速影響 不同洗脫流速對杜仲多糖的洗脫率影響，見圖5。

圖5 洗脫流速對洗脫率的影響Fig.5 Effect of eluent flow rate on desorption rate

由圖5可見，隨著洗脫流速的增大，洗脫率不斷降低，這歸因于流速過快，不利于洗脫液和多糖充分接觸，因此，選擇 0.5、1.0、2.0mL·min-1作為正交試驗(yàn)中洗脫流速的考察水平。

2.2.6 洗脫液體積影響 不同洗脫液體積對杜仲多糖的洗脫率影響，見圖6。

圖6 洗脫液體積對洗脫率的影響Fig.6 Effect of eluent volume on desorption rate

從圖6可見，當(dāng)洗脫液用量增至140mL時，洗脫率逐漸趨于平衡，因此選擇140、150、160mL作為正交試驗(yàn)中洗脫液體積的考察水平。

2.3 動態(tài)吸附工藝考察

在動態(tài)吸附單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采取三因素三水平正交試驗(yàn)，以樹脂的吸附率為衡量指標(biāo)，確定吸附工藝最佳條件，具體因素考察水平見表2，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 吸附正交試驗(yàn)因素水平Tab.2 Factor level table of adsorption orthogonal test

表3 吸附條件正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of adsorption orthogonal test

從表3極差分析結(jié)果可知，各因素影響大孔樹脂吸附杜仲多糖的順序依次為提取液濃度＞上樣流速＞提取液pH值，最佳吸附工藝條件為A2B2C1，即0.6mg·mL-1，pH 值 為 6.0 杜 仲 多糖 提 取 液 ，以1.0mL·min-1流速上樣至AB-8型大孔樹脂中。

2.4 動態(tài)洗脫工藝考察

分別收集表3試驗(yàn)中9份洗脫液，根據(jù)表4洗脫試驗(yàn)的因素考察水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)，測定各自多糖含量，并計(jì)算洗脫率，結(jié)果見表5。

表4 洗脫正交試驗(yàn)因素水平Tab.4 Factor level table of desorption orthogonal test

表5 洗脫條件正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of desorption orthogonal test

從表5極差分析結(jié)果可知，各因素對洗脫效果影響的順序依次為洗脫液濃度＞洗脫液體積＞洗脫流速，最佳洗脫工藝條件為A1B2C2，即選擇體積為150mL，65%乙醇溶液，以 1.0mL·min-1流速洗脫AB-8型大孔樹脂吸附的杜仲多糖。

2.5 工藝驗(yàn)證與含量結(jié)果比較

0.6 mg·mL-1，pH值為6.0的杜仲多糖提取液，以1.0mL·min-1流速，上樣至AB-8型大孔樹脂吸附后，采用體積為150mL，65%乙醇溶液，于1.0mL·min-1流速洗脫，測得樹脂吸附率與解吸率分別為91.6%和90.2%，而產(chǎn)物的多糖含量由純化前10.2%提高至純化后35.8%，約為純化前的3.5倍。

2.6 負(fù)重游泳時間比較

由于負(fù)重游泳時間間接反映不同物質(zhì)的抗疲勞作用效果，因此，對3組小鼠的負(fù)重游泳時間進(jìn)行比較，結(jié)果見表6。

表6 不同組別小鼠的負(fù)重游泳時間Tab.6 Swimming times of different groups of mice

與對照組相較，其它各組小鼠的負(fù)重游泳時間均有所延長，而純化組小鼠的游泳時間最長，差異具有極顯著性（P＜0.01），表明經(jīng)純化后的杜仲多糖有助于提高小鼠的運(yùn)動時長。

2.7 乳酸生化指標(biāo)影響

表7為不同物質(zhì)對運(yùn)動后小鼠的體內(nèi)乳酸生化指標(biāo)影響比較。

表7 不同物質(zhì)對運(yùn)動后體內(nèi)乳酸生化指標(biāo)影響Tab.7 Effect of different materialson biochemical indexes of lactic acid after exercise

與對照組相較，喂養(yǎng)混有多糖飼料的小鼠在劇烈運(yùn)動后，體內(nèi)乳酸濃度明顯偏低，且乳酸脫氫酶活力顯著提高，特別是純化組小鼠的兩類指標(biāo)差異最為突出（P＜0.01），表明杜仲多糖有助于改善小鼠體內(nèi)的乳酸脫氫酶活力，加快體內(nèi)乳酸代謝排出，從而抵抗運(yùn)動疲勞狀態(tài)。

3 結(jié)論

本研究通過大孔樹脂分離純化杜仲多糖提取物，利用單因素與正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳純化工藝為：濃度為0.6mg·mL-1，pH值為6.0的杜仲多糖提取液，以1.0mL·min-1流速，上樣至AB-8型大孔樹脂吸附后，通過體積為150mL，65%乙醇溶液，以1.0mL·min-1流速洗脫，樹脂對多糖的吸附率和解吸率分別為90.6%、90.2%，而產(chǎn)物的多糖含量由10.2%提高至35.8%，約為純化前3.5倍。該純化工藝操作簡便、純化效率較高，所得產(chǎn)物可明顯改善運(yùn)動疲勞狀態(tài)，從而為杜仲多糖的后續(xù)保健開發(fā)提供參考。