趙 瑛，高偉瑩，余群星，王冬雪，劉 冰

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076)

Morris水迷宮(Morris water maze，MWM)是用于研究嚙齒類(lèi)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法[1].在用于學(xué)習(xí)記憶機(jī)制[2]、藥物對(duì)學(xué)習(xí)記憶的改善[3-4]、評(píng)價(jià)疾病模型等[5-9]研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)學(xué)者多采用測(cè)試期的逃避潛伏期平均數(shù)差別是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義來(lái)評(píng)價(jià)模型是否成功或藥物是否起到作用，而缺乏實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠學(xué)習(xí)規(guī)律的系統(tǒng)性研究與評(píng)價(jià).且不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每天訓(xùn)練次數(shù)及總訓(xùn)練時(shí)程各不同一，使得在進(jìn)行各實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比和評(píng)價(jià)時(shí)，會(huì)影響各實(shí)驗(yàn)結(jié)果間的比較和實(shí)驗(yàn)參考價(jià)值，使實(shí)驗(yàn)質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)效率降低.基于目前水迷宮實(shí)驗(yàn)存在的問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)采用文獻(xiàn)報(bào)道較多的每天訓(xùn)練2次、3次兩種不同的訓(xùn)練方式，考察不同訓(xùn)練方式對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶成績(jī)的影響，分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠學(xué)習(xí)成績(jī)變化規(guī)律，并得出不同訓(xùn)練方式下小鼠的最佳訓(xùn)練時(shí)程.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

ICR小鼠，雌雄各半，體重為(20±2)g，4～5周齡，SPF級(jí).由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供(許可號(hào)為SCXK(吉)-2011-0004；長(zhǎng)春，中國(guó)).3批次合格證號(hào)分別為：20141302；201411413；20143617.將室溫控制在(23±2)℃的范圍內(nèi)，相對(duì)濕度45%～55%，動(dòng)物自由飲水?dāng)z食.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中做到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則，并給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人道關(guān)懷.

3批ICR小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，按體重性別隨機(jī)分為2 次/d組(每天訓(xùn)練2次)和3 次/d組(每天訓(xùn)練3次).第1批2 次/d組(n=17)、3 次/d組(n=20)；第2批2 次/d組(n=17)、3 次/d組(n=21)；第3批2 次/d組(n=47)、3 次/d組(n=30).

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

MT-200 Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)，購(gòu)自成都泰盟科技有限公司.包括MT-200 Morris水迷宮：水迷宮圓形水池(D=120 cm，h=30 cm)；平臺(tái)(D=8 cm，h=15 cm).

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

二氧化鈦：購(gòu)自天津多福源實(shí)業(yè)有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：Q/12JH4152；染色用苦味酸(2，4，6-三硝基酚)：購(gòu)自汕頭市西隴化工廠(chǎng)有限公司.

1.2 方法

1.2.1 適應(yīng)性訓(xùn)練

正式實(shí)驗(yàn)前一天，不放置平臺(tái)，讓小鼠自由游泳120 s.訓(xùn)練完畢后立即取出小鼠并擦干以避免應(yīng)激反應(yīng).

1.2.2 定位航行實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前，將不同標(biāo)記物分別貼在4個(gè)象限.平臺(tái)在水面以下1 cm處，水溫控制在(20.0±2)℃，并用二氧化鈦將水染成乳白色.實(shí)驗(yàn)時(shí)將小鼠在除目標(biāo)象限(平臺(tái)所在象限)之外的三個(gè)象限隨機(jī)面對(duì)池壁放入水中，當(dāng)小鼠找到平臺(tái)后，記錄潛伏期，并在平臺(tái)上停留30 s；如果小鼠在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，潛伏期記為120 s，并引導(dǎo)小鼠在平臺(tái)上停留30 s，讓其根據(jù)四個(gè)象限的參照物進(jìn)行空間學(xué)習(xí)記憶.每次訓(xùn)練完成后將小鼠立即取出并擦干以避免應(yīng)激反應(yīng).記錄小鼠的游泳速度，逃避潛伏期、外環(huán)滯留時(shí)間百分比，目標(biāo)象限滯留時(shí)間百分比等指標(biāo).

2 次/d組于每天10 點(diǎn)、14 點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)；3 次/d組于每天8 點(diǎn)、12 點(diǎn)、16 點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn).

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過(guò)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，當(dāng)符合正態(tài)分布時(shí)，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；組內(nèi)三批次間比較采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布時(shí)，則采用秩和檢驗(yàn).以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 游泳速度變化

2.1.1 組內(nèi)游泳速度比較

同一訓(xùn)練次數(shù)下，2 次/d組和3 次/d組不同批次小鼠間的游泳速度比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見(jiàn)圖1、2.

2.1.2 兩組游泳速度比較

由于每組不同批次小鼠之間的游泳速度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此將每組的三批實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別合并為大數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.同一訓(xùn)練次數(shù)下，2 次/d、3 次/d組小鼠游泳速度比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).說(shuō)明兩組小鼠的體力沒(méi)有差別，并且隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加小鼠的游泳速度也無(wú)明顯的變化，見(jiàn)圖3.

圖1 2 次/d組3批小鼠游泳速度

圖2 3 次/d組3批小鼠游泳速度

圖3 2 次/d組與3 次/d組游泳速度

2.2 外環(huán)滯留時(shí)間百分比比較

2.2.1 組內(nèi)外環(huán)滯留時(shí)間百分比比較

同一訓(xùn)練次數(shù)下，2 次/d組和3 次/d組不同批次小鼠間的外環(huán)滯留時(shí)間百分比比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，如圖4、5.

圖4 2 次/d組3批小鼠外環(huán)滯留時(shí)間百分比

圖5 3 次/d組3批小鼠外環(huán)滯留時(shí)間百分比

2.2.2 兩組外環(huán)滯留時(shí)間百分比比較

由于兩組不同批次小鼠間的外環(huán)滯留時(shí)間百分比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此分別將每組的三批實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)合并成大數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.同一訓(xùn)練次數(shù)下，2 次/d、3 次/d組小鼠的外環(huán)滯留時(shí)間百分比比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).與自身第1次外環(huán)滯留時(shí)間百分比相比，2 次/d組和3 次/d組小鼠分別在第3次和第4次開(kāi)始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，并分別從第3次和第4次開(kāi)始趨于穩(wěn)定，見(jiàn)圖6.

2.3 目標(biāo)象限滯留時(shí)間百分比比較

2.3.1 組內(nèi)目標(biāo)象限滯留時(shí)間百分比比較

同一訓(xùn)練次數(shù)下，2 次/d組和3 次/d組不同批次小鼠間的目標(biāo)象限滯留時(shí)間百分比比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見(jiàn)圖7、8.

注：2 次/d組n=81，與第1次比較：*P<0.05；3 次/d組n=71，與第1次比較：△P<0.05

圖6 2 次/d組與3 次/d組外環(huán)滯留時(shí)間百分比

圖7 2 次/d組3批小鼠目標(biāo)象限滯留時(shí)間百分比

圖8 3 次/d組3批小鼠目標(biāo)象限滯留時(shí)間百分比

2.3.2 兩組目標(biāo)象限滯留時(shí)間百分比比較

由于兩組不同批次小鼠間目標(biāo)象限滯留時(shí)間百分比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此分別將兩組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)合并成大數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.與自身第1次訓(xùn)練目標(biāo)象限滯留時(shí)間百分比相比，2 次/d組和3 次/d組均在第3次開(kāi)始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).同一訓(xùn)練次數(shù)下兩組比較，僅在第13次出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其他訓(xùn)練次數(shù)兩組總樣本比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).見(jiàn)圖9.

注：vs第1次訓(xùn)練：2 次/d組，*P<0.05；3 次/d組，△P<0.05；vs 2 次/d組：□P<0.05

圖9 2 次/d組與3 次/d組目標(biāo)象限滯留時(shí)間百分比

2.4 逃避潛伏期變化

2.4.1 組內(nèi)逃避潛伏期比較

同一訓(xùn)練次數(shù)下，2 次/d組和3 次/d組不同批次小鼠間的逃避潛伏期比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見(jiàn)圖10、11.

圖10 2 次/d組3批小鼠逃避潛伏期

圖11 3 次/d組3批小鼠逃避潛伏期

2.4.2 兩組逃避潛伏期比較

由于2 次/d組和3 次/d組不同批次小鼠間逃避潛伏期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此分別將兩組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)合并成大數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.與自身第1次訓(xùn)練比較：2 次/d組和3 次/d組分別在第3次和第4次開(kāi)始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).同一訓(xùn)練次數(shù)下兩組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見(jiàn)圖12.

注：2 次/d組n=81，與第1次比較：*P<0.05；3 次/d組n=71，與第1次比較：△P<0.05

圖12 2 次/d組與3 次/d組逃避潛伏期

2.4.3 不同訓(xùn)練次數(shù)下的學(xué)習(xí)成績(jī)提高率

為更準(zhǔn)確描述小鼠學(xué)習(xí)成績(jī)與訓(xùn)練次數(shù)之間的關(guān)系，設(shè)定t與t′分別為第(n-1)次與第n次訓(xùn)練時(shí)小鼠的逃避潛伏期，小鼠登錄平臺(tái)學(xué)習(xí)最長(zhǎng)時(shí)限T=120 s，因此得出第n次訓(xùn)練時(shí)小鼠學(xué)習(xí)成績(jī)提高率P=[(t-t′)/120]*100%.

對(duì)兩組小鼠各次訓(xùn)練時(shí)其學(xué)習(xí)成績(jī)提高率進(jìn)行分別計(jì)算，如表1結(jié)果所示.通過(guò)對(duì)兩組小鼠的學(xué)習(xí)成績(jī)提高率進(jìn)行分析可得，2 次/d組學(xué)習(xí)成績(jī)提高率的最大差值在第3次與第4次訓(xùn)練間為25.2%；3 次/d組學(xué)習(xí)成績(jī)提高率的最大差值在第4次和第5次訓(xùn)練間為7.7%.

2.4.4 連續(xù)兩次逃避潛伏期低于70 s所占百分比

與第1次訓(xùn)練時(shí)的逃避潛伏期相比，2 次/d組和3 次/d組分別在第3次和第4次出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)差異，并且兩組的成績(jī)提高率的最大差值分別在第3次和第4次，因此綜合判定第3次和第4次分別為2 次/d組和3 次/d組的學(xué)習(xí)成績(jī)拐點(diǎn).此時(shí)兩組的逃避潛伏期均在70 s左右，為避免偶然性，我們選擇逃避潛伏期連續(xù)2次低于70 s作為小鼠記憶形成的標(biāo)準(zhǔn).

如表2結(jié)果所示，第9次結(jié)束訓(xùn)練后，2 次/d組和3 次/d組連續(xù)2次逃避潛伏期低于70 s的小鼠占總數(shù)的80.25%和81.69%.在10～15次訓(xùn)練，兩組余下20%的小鼠出現(xiàn)連續(xù)2次逃避潛伏期低于70 s所占百分比均在5%以下.

表1 兩組小鼠不同訓(xùn)練次數(shù)下的學(xué)習(xí)成績(jī)提高率(%)

表2 兩組逃避潛伏期連續(xù)兩次低于70 s所占百分比(%)

3 討 論

在MWM實(shí)驗(yàn)中，小鼠可通過(guò)一定時(shí)程的多次訓(xùn)練而獲得對(duì)空間的認(rèn)知.但目前訓(xùn)練方式、總訓(xùn)練時(shí)程對(duì)訓(xùn)練有無(wú)影響以及選取哪種訓(xùn)練方式缺乏相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)依據(jù).查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)有每天訓(xùn)練1次、5天共5次[10]，每天訓(xùn)練2次、4天共8次[11-12]，每天訓(xùn)練3次、5天共15次[13]，每天訓(xùn)練4次、4天共16次[14]，每天8次、2天共16次[15]等，其中應(yīng)用較多的是每天訓(xùn)練2次或3次、總訓(xùn)練次數(shù)15次.因此本文選擇每天訓(xùn)練2、3次、總訓(xùn)練次數(shù)15次進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，以游泳速度判斷各組及各批次小鼠學(xué)習(xí)成績(jī)的差異非體力及速度差異所致；以逃避潛伏期并輔以外環(huán)滯留時(shí)間百分比及目標(biāo)象限滯留時(shí)間百分比進(jìn)行學(xué)習(xí)成績(jī)判定.結(jié)果顯示連續(xù)15次訓(xùn)練完成后，同一訓(xùn)練次數(shù)下，2 次/d組和3 次/d組小鼠相比各指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；每組不同批次小鼠間各指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.說(shuō)明兩種訓(xùn)練方式小鼠學(xué)習(xí)成績(jī)沒(méi)有明顯差別，且本實(shí)驗(yàn)選擇的兩種訓(xùn)練方式具有良好的重現(xiàn)性，因此建議根據(jù)實(shí)驗(yàn)具體情況選擇每天訓(xùn)練2次或3次均可.

為探究小鼠學(xué)習(xí)記憶規(guī)律，本文對(duì)兩組各3批小鼠的學(xué)習(xí)記憶成績(jī)進(jìn)行了動(dòng)態(tài)分析.結(jié)果顯示：與自身第1次相比，2 次/d組小鼠除游泳速度外的各項(xiàng)指標(biāo)均在第3次開(kāi)始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且2 次/d組學(xué)習(xí)成績(jī)提高率的最大差值在第3次與第4次訓(xùn)練之間，即2 次/d組小鼠于第3次訓(xùn)練時(shí)學(xué)習(xí)成績(jī)出現(xiàn)拐點(diǎn).3 次/d組小鼠除游泳速度外的各項(xiàng)指標(biāo)均在第3或4次訓(xùn)練時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并且3 次/d組學(xué)習(xí)成績(jī)提高率的最大差值在第4次與第5次之間，即3 次/d組小鼠于第4次訓(xùn)練時(shí)出現(xiàn)學(xué)習(xí)成績(jī)拐點(diǎn).

由于第3次和第4次分別為2 次/d組和3 次/d組的學(xué)習(xí)成績(jī)拐點(diǎn)，并且與自身第1次學(xué)習(xí)成績(jī)相比，2 次/d組和3 次/d組的各項(xiàng)指標(biāo)均在第3或4次開(kāi)始出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，此時(shí)兩組的逃避潛伏期均在70 s左右，因此我們認(rèn)為當(dāng)實(shí)驗(yàn)小鼠學(xué)習(xí)成績(jī)出現(xiàn)拐點(diǎn)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異時(shí)的逃避潛伏期(本文為70 s)可以表示其開(kāi)始對(duì)平臺(tái)所在位置形成記憶.本實(shí)驗(yàn)在單次訓(xùn)練時(shí)間120 s情況下，以小鼠逃避潛伏期連續(xù)2次低于70 s(即出現(xiàn)學(xué)習(xí)成績(jī)拐點(diǎn)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異時(shí)的逃避潛伏期)作為單只小鼠記住平臺(tái)位置的標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)討論小鼠在何時(shí)對(duì)平臺(tái)形成記憶.實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組小鼠在第9次訓(xùn)練后，連續(xù)2次逃避潛伏期低于70 s的小鼠均占80%以上，且在第10～15次訓(xùn)練結(jié)束后余下20%的小鼠逃避潛伏期連續(xù)2次低于70 s所占百分比均在5%以下.表明小鼠經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的學(xué)習(xí)后，其學(xué)習(xí)成績(jī)會(huì)穩(wěn)定在某一水平，隨訓(xùn)練時(shí)間延長(zhǎng)成績(jī)提高緩慢，過(guò)多的訓(xùn)練次數(shù)反而會(huì)加重實(shí)驗(yàn)負(fù)擔(dān).因此在進(jìn)行定位航行時(shí)推薦總訓(xùn)練次數(shù)為9～10次.同時(shí)建議可將學(xué)習(xí)記憶成績(jī)的變化軌跡作為觀(guān)察指標(biāo)用于動(dòng)物模型或藥物對(duì)學(xué)習(xí)記憶干預(yù)研究中.