田 野，李亞楠，吳 征，陳 強(qiáng)，曲 敏

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院 黑龍江省普通高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076)

冰結(jié)構(gòu)蛋白(ice structuring proteins, ISPs)，又稱(chēng)不凍蛋白、抗凍蛋白，是一類(lèi)由某些魚(yú)類(lèi)、昆蟲(chóng)、植物、真菌和細(xì)菌為抵御外界環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)所產(chǎn)生的多肽，能夠有效地抑制冰晶生長(zhǎng)的蛋白[1].它具有一定的熱滯活性，即能夠以非依數(shù)性方式降低溶液的冰點(diǎn)，但對(duì)熔點(diǎn)影響甚微，使溶液冰點(diǎn)和熔點(diǎn)之間出現(xiàn)差值[2].其中，植物源ISPs與動(dòng)物源ISPs相比具有來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，自1992年以來(lái)成為研究的熱點(diǎn)[3-4].

木瓜蛋白酶又稱(chēng)木瓜酶，是一類(lèi)含巰基肽鏈的內(nèi)切酶，廣泛存在于番木瓜(Cariea papaya)的根、莖、葉和果實(shí)內(nèi)，其中在未成熟的乳汁中含量最為豐富[5].它具有酶活高、熱穩(wěn)定性好、天然衛(wèi)生安全等特點(diǎn)，因此在食品[6]、醫(yī)藥[7]、飼料、日化、皮革及紡織等行業(yè)得到廣泛應(yīng)用[8].木瓜蛋白酶最適溫度為55～60 ℃，在低溫條件下，酶和底物的結(jié)合速率減慢，且木瓜蛋白酶中的肽鏈?zhǔn)湛s，不易與底物嵌合，酶活降低.

本課題組利用冰與冰結(jié)構(gòu)蛋白特異性結(jié)合法提取AISPs[9]，并將其應(yīng)用于冷凍面團(tuán)[10]、速凍餃子皮[9]等方面，發(fā)現(xiàn)AISPs對(duì)其具有明顯的保護(hù)作用.但木瓜冰結(jié)構(gòu)蛋白酶肽(Allium ice structural proteins peptide,AISPPs)的抗凍保護(hù)作用未見(jiàn)報(bào)道，故本試驗(yàn)將AISPPs加入木瓜蛋白酶中，探究其對(duì)木瓜蛋白酶的抗凍保護(hù)作用，以酶活性作為主要的功能性評(píng)價(jià)指標(biāo)，并對(duì)其凍干保護(hù)機(jī)理進(jìn)行初步探討，以期拓寬AISPPs的應(yīng)用.

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

“肇東”紫花苜蓿，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所苜蓿實(shí)驗(yàn)基地提供.Na2HPO4，NaH2PO4，乙醇，硫酸銨，丙酮，EDTA-2Na，氫氧化鈉，考馬斯亮藍(lán)G-250，鄰苯三酚，SOD，所有試劑均為分析純.標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶液，生化試劑.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平，沈陽(yáng)龍騰電子秤量?jī)x器公司；TGL-16型高速臺(tái)式離心機(jī)，上海醫(yī)療器械六廠；721型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；DHP-9162型光照培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；GW-06A電熱恒溫干燥箱，哈爾濱儀器五廠；ESJ 180-4型分析天平，沈陽(yáng)龍騰電子秤量?jī)x器公司；粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；BCD-247-C型電熱恒溫水浴鍋，聚創(chuàng)環(huán)保設(shè)備有限公司.

1.3 冰結(jié)構(gòu)蛋白的制備

參照曲敏[9]的方法，取苜蓿草粉以1∶20的料液比在磷酸緩沖溶液，磁力攪拌器攪拌、浸泡2 h，8層紗布及濾紙過(guò)濾，棄去草渣，上清液于5 000 r/min離心15 min，得可溶性蛋白的粗提液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定粗提液中蛋白含量，計(jì)算質(zhì)量,記為m1.

將蒸餾水注入圓球形冰槽，在-18 ℃冰箱冷凍，制成直徑為1 cm的冰球，備用.在上清液中加入冰球，于-18 ℃靜置，以冰球吸附上清液中的AISPs.2 min后，分離出冰球并待自然融化，測(cè)量溶液中蛋白含量，計(jì)算質(zhì)量為m2.最后將融化后的液體裝入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到的濃縮液即為AISPs溶液.

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

參照葉婧[11]的方法，采用考馬斯亮藍(lán)染料比色法，分別取0、10、20、30、40、50、60 mg/L牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品各1 mL，加入考馬斯亮藍(lán)G250溶液5 mL，充分混勻，靜置5 min，于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值.以牛血清蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以A595nm為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.5 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定

本試驗(yàn)采用福林酚試劑法[12]測(cè)定酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線.分別取1 mL質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50、60 μg/mL的酪氨酸溶液，加入0.5 mL 福林試劑、5 mL 0.4 mol/L Na2CO3均勻混合，于40 ℃水浴鍋中放置1 min，于680 nm下測(cè)定其吸光度，以空白組為對(duì)照，以酪氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.6 AISPPs的制備

用堿性蛋白酶對(duì)AISPs進(jìn)行酶解制備AISPPs，以蛋白水解度(DH)作為考察指標(biāo)，考察酶解時(shí)間、底物質(zhì)量濃度、酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、溶液pH、酶解溫度其酶解程度的影響.

1.6.1 酶解時(shí)間

酶解溫度55 ℃，反應(yīng)體系的pH為8.0，堿性蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%條件下分別酶解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，比較不同酶解時(shí)間對(duì)AISPs的水解程度.

1.6.2酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

酶解溫度55 ℃，反應(yīng)體系的pH為8.0條件下，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、3%、4%、5%、6%、7%的堿性蛋白酶，酶解2.5 h，比較不同酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)AISPs的水解程度.

1.6.3 酶解pH的影響

酶解溫度55℃，堿性蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%條件下，分別調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，酶解2.5 h，比較不同酶解pH對(duì)AISPs的水解程度.

1.6.4酶解溫度的影響

反應(yīng)體系的pH為8.0，堿性蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%條件下分別于45、50、55、60、65 ℃條件下進(jìn)行反應(yīng)，酶解2.5 h，比較不同酶解溫度對(duì)AISPs的水解程度.

1.6.5 蛋白水解度的測(cè)定

本試驗(yàn)采用甲醛滴定法測(cè)量蛋白質(zhì)水解度，取2 mL待測(cè)蛋白溶液，分別加入4 mL蒸餾水及酚酞溶液3滴，搖勻后用0.095 35 mol/L氫氧化鈉溶液滴至成微紅色，然后加入4 mL中性甲醛溶液，搖勻后靜置片刻.再用0.095 35 mol/L NaOH溶液滴至成為紅色，記下加入甲醛后所消耗的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉體積.以蒸餾水為對(duì)照，水解度按下式計(jì)算：

DH%=B(Mb)(1/α)(1/MP)(1/htot)×100%

(2)

其中：B為NaOH的體積，mL；Mb為NaOH的濃度，mol/L；1 /α為在pH 7.0，50 ℃的試驗(yàn)條件下，1 /α為2.26；MP為蛋白質(zhì)的品質(zhì)，g；htot為每克原料蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)，對(duì)AISPs蛋白該值取7.40 mmol/g.

1.7 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面法對(duì)堿性蛋白酶對(duì)AISPs的水解條件進(jìn)行優(yōu)化，選取酶解時(shí)間(A)、酶解pH(B)和酶解溫度(C)為考察因素，以DH為考察指標(biāo)，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn).見(jiàn)表1.

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平

采用BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法設(shè)立17組試驗(yàn)，各因素和響應(yīng)面值(DH)如表2所示，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，分析各因素的效應(yīng)，最后得到堿性蛋白酶對(duì)AISPs的水解條件最佳工藝.

1.8 AISPPs對(duì)木瓜蛋白酶的保護(hù)作用

1.8.1 不同凍藏時(shí)間的比較

取兩組木瓜蛋白酶各10 mL，一組加入0.3%的AISPPs，一組為空白對(duì)照，于-30 ℃凍藏5、10、15、20、25 d后木瓜蛋白酶活力，比較不同凍藏時(shí)間下加入AISPPs對(duì)木瓜蛋白酶的保護(hù)作用.

1.8.2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)AISPPs對(duì)木瓜蛋白酶酶活力的影響

取5組木瓜蛋白酶各10 mL，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的AISPPs，于-30 ℃凍藏5 d，測(cè)定木瓜蛋白酶活力，比較不同AISPPs對(duì)木瓜蛋白酶活力的影響.

表2 堿性蛋白酶對(duì)AISPs的水解條件響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線及AISPs提取率

由圖1可知，蛋白溶液的吸光度與質(zhì)量濃度存在正比例關(guān)系，線性關(guān)系良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)計(jì)算得出AISPs提取率約為37.77%.

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖2可知，酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.195 1x-0.151 3，線性關(guān)系良好，可用于其他待測(cè)蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)計(jì)算堿性蛋白酶的酶活性為9×104U/mg.

圖2 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 酶解單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 酶解時(shí)間

由圖3可知，水解度隨著酶解時(shí)間的增加，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)；當(dāng)酶解時(shí)間為2.5 h時(shí)，水解度達(dá)到最大值為15.3%，蛋白酶基本和蛋白質(zhì)完全作用，繼續(xù)水解底物質(zhì)量濃度會(huì)繼續(xù)減小，隨著水解的進(jìn)行酶的特異性催化位點(diǎn)減少，即水解過(guò)程中酶逐漸失活，故最佳酶解時(shí)間為2.5 h.

2.3.2 酶解質(zhì)量分?jǐn)?shù)

由圖4可知，水解度隨著酶解質(zhì)量分?jǐn)?shù)的逐漸升高，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì).當(dāng)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～ 4%時(shí)，酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的逐漸增加使反應(yīng)物逐漸達(dá)到反應(yīng)完全，AISPs水解度逐漸增加.當(dāng)酶解質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到4%時(shí)，水解度達(dá)到最大值為14.6%.此后再增加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)，增加了溶液體積，AISPPs被稀釋?zhuān)舛冉档?

圖3 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

圖4 酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)水解度的影響

2.3.3 酶解pH

圖5可知，水解度隨著酶解pH的逐漸升高，呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì).這是由于隨著pH的不斷增大，AISPs所帶的電荷不斷增多，蛋白與水之間的相互作用不斷增大，蛋白與蛋白之間的相互作用不斷減小.當(dāng)酶解pH達(dá)到4時(shí)，水解度達(dá)到最大值為16.2%.

圖5 酶解pH對(duì)水解度的影響

2.3.4 酶解溫度

由圖6可知，水解度隨著酶解溫度的逐漸升高，呈現(xiàn)先增大，后減小的趨勢(shì).當(dāng)在45～55 ℃時(shí)，溫度升高可以提高酶的活性，且有利于底物折疊結(jié)構(gòu)的展開(kāi)，水解度隨著溫度的增加而增加.當(dāng)酶解溫度達(dá)到55 ℃時(shí)，水解度達(dá)到最大值為16.3%，故最佳酶解溫度為55℃.當(dāng)在55～70 ℃時(shí)，此時(shí)溫度超過(guò)了酶的最適宜溫度時(shí)，酶逐漸失活，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解度下降.

圖6 酶解溫度對(duì)水解度的影響

2.4 堿性蛋白酶對(duì)AISPs的水解條件優(yōu)化

2.4.1 回歸方程的建立與方差分析

利用軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，擬合得到水解度的二次元回歸方程為：

DH%=16.5+1.61A+0.43B+0.22C+0.16AB+0.34AC+0.14BC-1.05A2-0.25B2-0.98C2

(3)

由表3可知，失擬項(xiàng)不顯著，表明模型的擬合程度良好，未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾較少，模型的方差分析說(shuō)明該模型已經(jīng)達(dá)到顯著水平(P<0.05).由P值可知各因素對(duì)堿性蛋白酶對(duì)AISPs的水解條件影響為：酶解時(shí)間>酶解pH>酶解溫度.校正系數(shù)R2Adj為0.95、變異系數(shù)(C.V.)為2.9%<10%、決定系數(shù)R2為0.43，說(shuō)明多項(xiàng)式模型的利用性和精密度是可行的，通過(guò)此模型方程能預(yù)測(cè)出堿性蛋白酶對(duì)AISPs在任何變量值下的水解條件.

表3 堿性蛋白酶對(duì)AISPs的水解條回歸模型

2.4.2 響應(yīng)面分析及驗(yàn)證

圖7～9是因素(酶解時(shí)間、酶解pH、酶解溫度)交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖.由圖7可知，隨著酶解時(shí)間的增大，堿性蛋白酶對(duì)AISPs的水解度呈現(xiàn)先有所增加后緩慢降低的趨勢(shì).酶解pH為 4～6時(shí)，提取率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)；等值線區(qū)域水平，表示酶解時(shí)間與酶解pH間具有顯著的交互作用.由圖8可知，隨著酶解pH的不斷增加，水解度呈現(xiàn)先增大后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)；隨著酶解溫度的逐漸增大，水解度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì).由圖9可知，隨著酶解溫度的不斷增高，水解率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì).

通過(guò)二次多項(xiàng)式回歸分析求最大值，得到堿性蛋白酶對(duì)AISPs的水解條件最佳工藝為：酶解時(shí)間為2.817 h，酶解pH為5.221，酶解溫度為50.593 ℃，在此條件下DH的理論預(yù)測(cè)值為16.04%.結(jié)合最優(yōu)工藝參數(shù)和實(shí)際生產(chǎn)可操作性，對(duì)各因素進(jìn)行修訂，最終確定最有工藝為：酶解時(shí)間為2.8 h，酶解pH為5.2，酶解溫度為50.6.在最佳工藝條件下，經(jīng)過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，DH為15.89%，與預(yù)測(cè)值相近，說(shuō)明優(yōu)化工藝重復(fù)性良好，最優(yōu)工藝的結(jié)果可靠.

圖7 酶解時(shí)間和酶解pH對(duì)水解條件的交互影響

圖8 酶解時(shí)間和酶解溫度對(duì)水解條件的交互影響

圖9 酶解pH和酶解溫度對(duì)水解條件的交互影響

2.5 AISPPs對(duì)木瓜蛋白酶的抗凍保護(hù)作用

由圖10可知，隨著冷凍天數(shù)的逐漸延長(zhǎng)，木瓜蛋白酶的酶活力逐漸降低，但加入AISPPs可明顯緩解低溫對(duì)其的損害.當(dāng)冷凍時(shí)間為25 d時(shí)，對(duì)照組木瓜蛋白酶酶活性為2.8×105U/mg；而實(shí)驗(yàn)組木瓜蛋白酶酶活性為4.1×105U/mg，相比對(duì)照組酶活性提高了46.43%.因此，添加AISPPs對(duì)木瓜蛋白酶活力具有一定的保護(hù)作用.隨著冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)，一方面，木瓜蛋白酶溶液中水分開(kāi)始結(jié)晶,蛋白酶分子側(cè)鏈在冰晶的擠壓下發(fā)生聚集，其周?chē)挠坞x水分子因重排布而失去復(fù)水力，逐漸導(dǎo)致木瓜蛋白酶變性;另一方面，未凍結(jié)時(shí)，部分木瓜蛋白酶分子以高度水化的折疊狀存在，非極性基團(tuán)相互作用形成非極性鍵，因?yàn)槲挥诿阜肿觾?nèi)部而避開(kāi)與水分子的接觸，所以狀態(tài)比較穩(wěn)定；但溫度降低時(shí)，冰晶的形成使木瓜蛋白酶水化程度降低，致使蛋白酶分子展開(kāi)變性[13].而AISPPs能吸附于冰晶表面，介于木瓜蛋白酶分子和水分子之間，阻止水與冰的接觸，從而抑制冰晶生長(zhǎng)，改變冰晶形態(tài)，抑制冰晶重結(jié)晶[14]，從而減緩了冰晶對(duì)木瓜蛋白酶的傷害.

圖10 冷凍時(shí)間對(duì)木瓜蛋白酶活力的影響

2.6 AISPPs添加量的確定

由圖11可知，隨著添加AISPPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，木瓜蛋白酶的酶活力呈現(xiàn)先增高后減小的趨勢(shì).當(dāng)AISPPs質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，木瓜蛋白酶活力達(dá)到最高值6.3×105U/mg.Carpenter J F等[15]發(fā)現(xiàn)ISPs相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)可顯著提高紅細(xì)胞的存活率；而較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)將致使紅細(xì)胞的存活率降低.其原因是ISPs具有雙重效應(yīng)，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，具有抑制大的冰晶形成的作用，表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)；而當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時(shí)，ISPs進(jìn)入磷脂雙分子層，破壞其結(jié)構(gòu)引起滲漏，影響了其與冰晶親和作用強(qiáng)度，促進(jìn)了大冰晶的形成，成為細(xì)胞膜毒害劑[3].說(shuō)明適宜的質(zhì)量分?jǐn)?shù)決定了其抗凍保護(hù)作用，而AISPPs的最適添加量為0.5%.

圖11 冰結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)木瓜蛋白酶活力的影響

3 結(jié) 語(yǔ)

本文利用冰結(jié)合磷酸緩沖液提取法提取AISPs，并用堿性蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解.通過(guò)單因素及響應(yīng)面法對(duì)AISPs的水解條件優(yōu)化，優(yōu)化結(jié)果為酶解時(shí)間為2.8 h，酶解pH為5.2，酶解溫度為50.6 ℃.在最佳工藝條件下，經(jīng)過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證，AISPs的DH%為15.89%，水解后得到苜蓿冰結(jié)構(gòu)蛋白肽，探究AISPPs對(duì)木瓜蛋白酶活力的影響.于-30 ℃凍藏5 d條件下，發(fā)現(xiàn)加入AISPPs可提高木瓜蛋白酶活力；當(dāng)冷凍時(shí)間為25 d時(shí)，對(duì)照組木瓜蛋白酶酶活性為2.8×105U/mg，實(shí)驗(yàn)組木瓜蛋白酶酶活性為4.1×105U/mg，相比對(duì)照組酶活性提高了46.43%.比較質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的AISPPs對(duì)木瓜蛋白酶活力的影響，發(fā)現(xiàn)AISPPs為0.5%時(shí)，木瓜蛋白酶活力達(dá)到最高值6.3×105U/mg.