蘇 適，馬 瑞，董立強，李 月，朱 桐，李鍵銘

(綏化學院 食品與制藥工程學院，黑龍江 綏化 152061)

黑豆屬一年生草本植物，為豆科植物種子，其中富含蛋白質、纖維素、維生素、碳水化合物和礦物質等營養(yǎng)成分[1].黑豆種皮中富含的花色苷具有抗氧化，抗突變，預防心血管疾病、清除自由基和改善視力等活性[2-5]，因此，對花青素的提取及應用的研究也越來越多.目前，花青素來源主要是從天然植物原料中獲取.

離子液體是由有機陽離子和無機陰離子構成的在室溫下呈液態(tài)的綠色有機溶劑，具有溶解性好、極性強、穩(wěn)定性好及黏度范圍可調節(jié)等特殊優(yōu)點，在天然產(chǎn)物提取領域應用越來越廣泛[6-8].微波輻射提取是利用電磁場的作用使樣品中的某些有機物成分與基體有效的分離，并能保持分析對象的化合物狀態(tài)不被破壞，保持成分的原有狀態(tài)[9-10].微波輔助提取法具有效率高、提取時間短、對環(huán)境友好等特點.本文首次采用離子液體的乙醇溶液為新型溶劑，與微波輔助提取技術結合從黑豆皮中提取花青素，通過單因素結合響應面試驗優(yōu)化提取工藝，為花青素提取工藝革新及及相關產(chǎn)品的應用研究提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藥材：黑豆，采購于黑龍江省綏化市.

原花青素標準品(質量分數(shù) 98 %)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1-丁基-3-甲基咪唑氯([BMIM]Cl)：阿爾法試劑有限公司；其他試劑均為分析純.

1.2 試驗儀器

MAS-3微波提取器，上海新儀微波化學科技有限公司；Alpha1502紫外分光光度計，上海譜元儀器有限公司；DFY-200C高速萬能粉碎機，上海皓莊儀器有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 標準曲線

稱取10 mg原花青素標準品，配成0.1 mg/mL的標準品溶液.分別移取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL標準品溶液置于10 mL的容量瓶中，加入5.00 mL 顯色劑(2.5 mL的0.01 g/mL香草醛甲醇溶液和2.5 mL 的8%的鹽酸甲醇溶液)，用1%的鹽酸甲醇溶液定容，恒溫水浴 30 min，花青素在530 nm波長處有最大吸收峰，在此波長下測出待測溶液的吸光度值.以花青素濃度為橫坐標(X)，吸光度為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，線性擬合方程為Y=0.962 0X+0.006 7，(R2=0.996 4).

1.3.2 黑豆的預處理及花青素的提取

黑豆清洗干凈后于60 ℃烘箱干燥，人工去皮，用高速多功能粉碎機粉碎后過60目篩，得黑豆皮粉末.以離子液體的乙醇溶液為溶劑，將一定量的黑豆皮粉放入微波提取器中，提取10 mim，結束后，將提取液離心30 min，取上清液備用.

1.3.3 花青素提取量的測定

取1.0 mL上清液于25 mL 容量瓶內定容，在530 nm 處測定吸光度，計算提取液中花青素提取量.

其中：C為花青素質量濃度(μg/mL)；V為定容體積(mL)；n為稀釋倍數(shù)；m為質量(g).

1.4 花青素提取的單因素實驗

取黑豆皮粉末0.5 g，微波輔助離子液體法提取黑豆皮花青素，考察微波功率(200、250、300、350、400、450 W)、離子液體濃度(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol/L)、料液比(1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30)對花青素提取量的影響.

1.5 響應面試驗設計

根據(jù)Box-Behnken Design方法設計試驗(表1).根據(jù)單因素試驗結果，以微波功率(A)、料液比(B)、離子液體濃度(C)為自變量，黑豆皮花青素收率為響應值量(Y)，優(yōu)化提取工藝，以花青素的提取量為響應值，建立黑豆皮花青素提取工藝優(yōu)化的二次模型，以確定微波輔助離子液體法提取花青素的最佳工藝條件.

表1 響應面試驗設計

2 試驗結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 浸泡時間對提取量的影響

由圖1可知，浸泡時間會影響黑豆皮中有效成分的溶出量，因此，實驗考察了不同浸泡時間(10、20、30、40、50、60 min)對黑豆皮花青素提取量的影響.取1.00 g 黑豆皮粉末浸泡于20 mL 離子液體的乙醇溶液中.實驗結果如圖1所示，在浸泡時間試驗設定范圍內，花青素的提取量隨時間的延長而增大，當浸泡時間超過 50 min后，提取量沒有明顯變化.可能是花青素與溶質之間的擴散傳質作用達到了平衡，花青素不再繼續(xù)溶出[11]，提取量沒有顯著變化.所以，綜合考慮響應面法試驗設計方案，黑豆皮粉末浸泡時間選擇50 min.

圖1 浸泡時間對提取量的影響

2.1.2 離子液體濃度對提取量的影響

由圖2可知，在離子液體濃度試驗設定范圍內，花青素的提取量也隨著[BMIM]Cl 濃度的增加先增大之后降低，當[BMIM]Cl 的濃度達到1.0 mol/L時，花青素提取量達最大.原因可能是當[BMIM]Cl 的濃度增加時，離子液體對花青素的溶解性能增強，但離子液體的黏度也隨之增大，溶劑的擴散能力降低，提取的花青素不易擴散到溶液中[12]，其他雜質成分的溶出量也同時增多.所以，綜合考慮響應面法試驗設計方案，離子液體濃度選擇1.0 mol/L.

圖2 離子液體濃度對提取量的影響

2.1.3 微波功率對提取量的影響

由圖3可知，在微波功率試驗設定范圍內，花青素提取量隨著功率的增強先增大后下降，花青素的提取量在功率為400 W時達到最大.微波輻射功率增強時，輻射能會加大溶劑分子對樣品基體的滲透能力，產(chǎn)生的壓力能夠破壞細胞壁，有利于花青素的溶出[13-14].當微波的功率超過400 W 時，微波產(chǎn)生的局部升溫過快可能會容易造成不穩(wěn)定的目標提取物降解.所以，微波功率選擇 400 W進行試驗.

圖3 微波功率對提取量的影響

2.1.4 料液比對提取量的影響

由圖4可知，在料液比試驗設定范圍內，花青素提取量隨著料液比的增大先增加后降低，當料液比達到1∶20時花青素的提取量達到最大.這可能是由于增加提取溶劑的體積使得樣品與提取溶液充分接觸，提取到的目標產(chǎn)物隨之越多；當料液比繼續(xù)增加時，樣品中的其他成分的溶出量也會增大，花青素的提取率降低[15-16].所以，響應面法試驗設計方案中，最佳的料液比為 1∶20.

圖4 料液比對提取量的影響

2.2 響應面結果分析

2.2.1 數(shù)學模型預測及和驗證

經(jīng)軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到黑豆皮花青素得率(Y)的回歸模型為得到二次回歸擬合方程Y=4.13+0.045A+ 0.081B+0.13C+0.029AB-0.059AC-0.094BC-0.45A2-0.41B2-0.20C2

表2 回歸分析結果

由表3方差分析結果得到，P<0.000 1，說明模型達到極顯著水平；失擬值P=0.784 9>0.05，模型不顯著，說明非試驗因素對試驗結果的影響不大.該模型決定系數(shù)R2=0.993 7，表明該模型99.37%的響應面變化可以通過擬合模型來解釋，試驗誤差小，可用于黑豆皮花青素提取工藝的優(yōu)化.回歸方程各項方差分析表明，單因素的影響大小為C>B>A，即離子液體濃度>料液比>微波功率.回歸模型一次項 B、C(P< 0.01)為模型極顯著因素，二次項 A2、B2、C2(P< 0.01)對結果影響極其明顯，交互項 AC(P<0.05)對結果影響顯著.

表3 方差分析表

注：P>0.05為不顯著；P<0.05為顯著；P<0.01為極顯著

2.2.2 響應面分析

響應面和相應的等高線圖能最直觀地反映任意兩個因素交互作用與響應值的作用關系.如果響應曲面較陡峭，等高線越近似橢圓，說明該因素響應值受變量交互作用顯著；反之則說明交互作用關系越弱，對響應值的影響越不顯著[17].由圖5可得到結論：微波功率與料液比交互作用影響較小，料液比與離子液體濃度、微波功率與離子液體濃度交互作用影響較大，與方差分析結果一致.

圖5 各因素交互作用的響應面圖

2.2.3 驗證試驗

通過上述響應面試驗分析，得出黑豆皮花青素的最佳提取條件：離子液體濃度1.06 mol/L，微波功率406.09 W，料液比1∶20.33，理論預計值4.155 mg/g.綜合考慮，將工藝條件修正為離子液體濃度1.0 mol/L，微波功率400 W，料液比:1∶20，在優(yōu)化條件下實際測得花青素提取量為4.146 mg/g，相差 0.22%，說明此模型準確可靠，可利用響應面法對黑豆皮花青素的提取工藝進行優(yōu)化.

3 結 語

本試驗采用微波輔助離子液體法提取黑豆皮中的花青素，通過采用Box-Benhnken中心組合試驗原理設計及優(yōu)化，優(yōu)化最佳工藝條件：離子液體濃度1.0 mol/L，微波功率400 W，料液比1∶20.在此條件下，花青素提取量為4.146 mg/g.離子液體具有可設計性、溶解性強，可以對中藥中的復雜成分進行選擇性提取，提取過程快速高效、操作便捷和環(huán)境友好等特點，在中藥提取領域具有廣闊的前景.本文采用微波輔助離子液體提取黑豆皮中花青素，該工藝提取時間短，操作簡單，避免溶劑揮發(fā)，可為開發(fā)天然色素的研究提供理論依據(jù).