任彥紅，孫建紅，侯世科，程 明

胃癌是全球第四常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是癌癥致死的第三大病因[1-3]，晚期胃癌患者的5年生存率僅為20%[4]。探究胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)對(duì)提高胃癌患者的預(yù)后尤為重要。微小RNA(MicroRNA， miRNA)是一種內(nèi)源性短鏈RNA，miRNA表達(dá)失調(diào)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[5]。有研究表明miR-96與胃癌的發(fā)生、浸潤(rùn)程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，但在國(guó)內(nèi)卻鮮有相關(guān)報(bào)道。為此本研究擬首先通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)探索miR-96表達(dá)水平與患者遠(yuǎn)期生存率的關(guān)系，及miR-96潛在靶基因，隨后利用我院臨床病理樣本進(jìn)行驗(yàn)證miR-96和其靶基因在胃癌組織、癌周組織中的表達(dá)差異，探討其與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1遠(yuǎn)期生存率比較 從包含TCGA數(shù)據(jù)網(wǎng)站下載胃癌患者數(shù)據(jù)集TCGA-miRNA、TCGA-RNA和TCGA-Clinical，篩選出同時(shí)包含生存時(shí)間數(shù)據(jù)信息和miR-96表達(dá)數(shù)據(jù)的患者共362例，按照miR-96表達(dá)水平由高到低排序，將排在前50%的患者181例設(shè)為高表達(dá)組，其余181例設(shè)為低表達(dá)組，并繪制2組生存曲線。

1.2相關(guān)靶基因篩選 利用Omisc軟件，將TCGA-RNA數(shù)據(jù)集中包含的所有基因表達(dá)水平逐一與miR-96表達(dá)水平進(jìn)行Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)，根據(jù)相關(guān)系數(shù)選取與miR-96表達(dá)水平相關(guān)性最高的基因。

1.3臨床資料 收集2018年2月—2019年2月在我院行手術(shù)切除的胃癌組織和癌周組織80例，均經(jīng)病理學(xué)確診。術(shù)中將組織標(biāo)本置入無(wú)RNA酶的凍存管中，然后立即放入液氮中，24 h后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?1例，女29例；年齡36～76(59.2±7.7)歲；按分化程度分為高、中、低分化，高分化13例，中分化28例，低分化39例；參照國(guó)際抗癌聯(lián)盟和美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)2010年共同發(fā)布的胃癌TNM分期法，將患者分為TNM Ⅰ～Ⅱ期29例，Ⅲ～Ⅳ期51例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例；按照胃癌Luaren分型標(biāo)準(zhǔn)[6]將腫瘤分為腸型40例，彌漫型23例，混合型17例。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time-quantitative polymerase chain reaction， RT-qPCR)檢測(cè)組織miR-96及其靶基因的表達(dá) 采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)組織miR-96及其靶基因腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor， BDNF)mRNA表達(dá)。將胃癌組織和癌周組織研磨成粉末，加入Trizol試劑中提取總mRNA；使用Roche逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(瑞士Roche公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；在ABI Prism 7300熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)上進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，采用SYBR Green Master(ROX)反應(yīng)體系；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，95℃變性20 s，60℃退火1 min，共40個(gè)循環(huán)。引物序列：GAPDH，上游引物5'-CACUCAAGAUUGUCAGCAATT-3'，下游引物5'-UUGCUGACAAUCUUGAGUGAG-3'；miR-96，上游引物5'-AATGCGGGGCTAGGGCTA-3'，下游引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；BDNF，上游引物5'- GATGCTGCAAACATGTCCATGAG-3'，下游引物5'-TTTTGTCTGCCGCCGTTACC-3'。用2-ΔΔCt法計(jì)算組織miR-96和BDNF mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1miR-96表達(dá)差異對(duì)生存時(shí)間的影響 miR-96高表達(dá)組中位生存時(shí)間高于miR-96低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2相關(guān)靶基因篩選 在11 193個(gè)mRNA中，BDNF是臨床信息完整且與miR-96相關(guān)性最高的靶基因(r=-0.232，P<0.001)。

圖1 miR-96高表達(dá)組和低表達(dá)組胃癌患者生存曲線

2.3胃癌和癌周組織中miR-96、BDNF mRNA表達(dá)量比較 以癌周組織mRNA表達(dá)量為基準(zhǔn)，對(duì)胃癌組織mRNA表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。胃癌組織中miR-96 mRNA表達(dá)量明顯低于癌周組織,BDNF mRNA表達(dá)量明顯高于癌周組織(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 胃癌和癌周組織中miR-96、BDNF mRNA表達(dá)水平比較

注：BDNF為腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；與癌周組織比較，bP<0.01

2.4胃癌組織中miR-96、BDNF mRNA表達(dá)量與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 miR-96 mRNA低表達(dá)和BDNF mRNA高表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及Luaren分型有關(guān)(P<0.05，P<0.01)；而miR-96和BDNF mRNA表達(dá)與胃癌患者年齡、性別、腫瘤直徑無(wú)顯著關(guān)聯(lián)(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 胃癌組織中miR-96和BDNF mRNA表達(dá)量與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系(例)

注：BDNF為腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

2.5胃癌組織中miR-96、BDNF mRNA表達(dá)量相關(guān)性分析 胃癌組織中miR-96和BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.342,P=0.002)。見(jiàn)圖2。

圖2 胃癌組織中miR-96、BDNF mRNA相對(duì)表達(dá)量相關(guān)性分析

BDNF為腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

3 討論

胃癌是消化道最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全世界每年新增胃癌病例約85萬(wàn)、因胃癌死亡病例約65萬(wàn)[7-8]。胃癌的危險(xiǎn)因素包括幽門螺桿菌感染、不良飲食習(xí)慣、吸煙和肥胖等。然而，胃癌的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚[1，9]。尋找胃癌特異性分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)對(duì)胃癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估和治療具有重要意義[10-11]。

miRNA是一類長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼短鏈RNA，通過(guò)與其靶基因3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而產(chǎn)生mRNA降解或翻譯抑制，在細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用[12-13]。近年來(lái)，已經(jīng)證實(shí)miRNA在多種人類腫瘤中異常表達(dá)，如胃癌、肺癌和膀胱癌等[14-17]。其中，miR-96在多種腫瘤中表達(dá)異常。研究表明，miR-96在肝細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)，且miR-96低表達(dá)與微血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)，且miR-96低表達(dá)的肝細(xì)胞癌患者總體生存率較高表達(dá)者更差[18]。Patani等[19]研究發(fā)現(xiàn)，miR-96在胃癌細(xì)胞系和組織樣本中表達(dá)下調(diào)，miR-96 mRNA表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)深度和TNM分期呈負(fù)相關(guān)，表明miR-96低表達(dá)與胃癌的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)；研究還指出miR-96 mRNA表達(dá)上調(diào)可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。Liu等[14]研究指出胃癌組織中miR-96表達(dá)量較正常組織下調(diào)，并且miR-96可能通過(guò)靶向作用于B淋巴細(xì)胞瘤基因-2來(lái)抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而起到腫瘤抑制作用。胃癌Luaren分型是臨床上常用的組織學(xué)分型方法，其中彌漫型較腸型更易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移和周圍組織侵犯，預(yù)后較差[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中miR-96 mRNA表達(dá)量明顯低于癌周組織，且miR-96低表達(dá)與腫瘤低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期增加及Luaren分型腸型減少關(guān)系密切，提示miR-96可能是一種抑癌基因，其表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和惡性進(jìn)展。

BDNF位于11號(hào)染色體的短臂上，是大腦中重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)和功能發(fā)育的作用[17]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，BDNF還是一種重要的腫瘤調(diào)節(jié)因子，在多種人類腫瘤中異常上調(diào)，如乳腺癌、膀胱癌和肝細(xì)胞癌等[19-21]。Okugawa等[22]研究指出，BDNF在胃癌組織中的表達(dá)量明顯高于鄰近正常胃黏膜組織，且BDNF高表達(dá)與胃癌患者的血管浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜擴(kuò)散和不良預(yù)后密切相關(guān)；并指出BDNF及其受體(TrkB)通路的激活在胃癌發(fā)生、發(fā)展和惡性轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。竇維佳等[23]研究報(bào)道，BDNF在胃癌組織中表達(dá)明顯上調(diào)，與不良臨床病理特征密切相關(guān)。劉天卿等[24]研究表明，TrkB和BDNF表達(dá)上調(diào)可能在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。本研究結(jié)果顯示，BDNF在胃癌組織中的表達(dá)量明顯高于癌周組織，且BDNF高表達(dá)與腫瘤低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期增加及Luaren分型腸型減少有關(guān)，提示BDNF高表達(dá)可能是胃癌發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移及惡性程度增加的重要因素。本研究還發(fā)現(xiàn)胃癌組織中miR-96和BDNF mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示miR-96/BDNF通路可能在胃癌的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移和惡性轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，miR-96低表達(dá)和BDNF高表達(dá)與胃癌發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移及惡性程度增加關(guān)系密切， miR-96可能通過(guò)靶向調(diào)控BDNF來(lái)抑制胃癌的發(fā)生、進(jìn)展，miR-96和BDNF可能是胃癌早期診斷、預(yù)后評(píng)估和基因治療的重要靶點(diǎn)。