呂 薇，龍 波，魏秀麗

我國是肝癌的高發(fā)國家，但是肝癌的致病機(jī)制目前仍不清楚，給其防治帶來障礙，探討肝癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移機(jī)制一直是學(xué)者們關(guān)注的熱點(diǎn)問題[1]。微小RNA(microRNA， miRNA)是一種長約22 nt的非編碼性小片段RNA。近年來研究顯示，miRNA可以參與基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，調(diào)節(jié)靶蛋白的表達(dá)，可以參與到腫瘤的致病過程中[2]。miR-424是miR-16家族成員，miR-16家族對細(xì)胞周期和表型都具有調(diào)控作用，臨床研究發(fā)現(xiàn)，miR-424在結(jié)直腸癌、肺癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌等一些實(shí)體腫瘤中低表達(dá)，并且在肝癌患者中miR-424也呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，與患者的預(yù)后密切相關(guān)[3]。本研究從細(xì)胞水平探討miR-424對肝癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和侵襲活性的影響，以期探明miRNA-424在肝癌中的作用，為其臨床防治提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 肝癌HepG2細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，RMPI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國GIBCO公司，青霉素和鏈霉素、結(jié)晶紫、碘化丙啶(PI)、胰酶購自美國Sigma公司，Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自大連Takara公司，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。miR-424表達(dá)質(zhì)粒以及空質(zhì)粒載體購自上海吉瑪基因有限公司，miR-424和內(nèi)參U引物由上海吉瑪基因有限公司設(shè)計(jì)與合成，Transwell小室購于美國Corning公司。Step One Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀和酶標(biāo)儀為美國Bio-rad公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為美國貝克曼庫爾特公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌HepG2細(xì)胞在5% CO2、37℃條件下，培養(yǎng)于RMPI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素)，達(dá)到80%融合時(shí)胰酶消化傳代。

1.3miR-424基因轉(zhuǎn)染和鑒定 實(shí)驗(yàn)分為3組，空白對照組不做轉(zhuǎn)染處理，陰性對照組轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒載體，miR-424表達(dá)組轉(zhuǎn)染miR-424表達(dá)質(zhì)粒，取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，1×105個(gè)/孔接種到6孔板，細(xì)胞貼壁后換無胎牛血清培養(yǎng)基，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000試劑盒說明書操作，轉(zhuǎn)染2 h后換含胎牛血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后使用熒光定量PCR法進(jìn)行轉(zhuǎn)染結(jié)果鑒定，胰酶消化細(xì)胞離心后加入1 ml Trizol，按照試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA，然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒說明書操作檢測miR-424表達(dá)情況，PCR擴(kuò)增條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。對照內(nèi)參用2-ΔΔCt表示miR-424的相對表達(dá)水平。

1.4細(xì)胞增殖能力檢測 使用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測HepG2細(xì)胞增殖能力，取上述3組對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，1×104個(gè)/孔接種到培養(yǎng)皿，72 h后70%乙醇固定后加入0.5%結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗滌后計(jì)算克隆形成率=克隆數(shù)/1×104×100%。

1.5細(xì)胞周期檢測 使用流式細(xì)胞儀檢測HepG2細(xì)胞周期的變化，取上述3組對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，1×105個(gè)/孔接種到6孔板，培養(yǎng)48 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，4℃條件下無水乙醇固定過夜，加入10 μg/ml PI染色30 min后，上流式細(xì)胞儀檢測，使用貝克曼庫爾特公司研發(fā)的CXP流式分析軟件分析細(xì)胞周期。

1.6細(xì)胞侵襲活性檢測 使用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測HepG2細(xì)胞侵襲活性，取上述3組對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，1×105個(gè)/孔接種到Transwell小室，培養(yǎng)48 h后，4%甲醛固定后0.5%結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡計(jì)數(shù)每高倍鏡視野(200×)下穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算5個(gè)視野取平均值。

2 結(jié)果

2.1miR-424轉(zhuǎn)染效果分析 空白對照組、陰性對照組和miR-424表達(dá)組miR-424的2-ΔΔCt值分別為0.24±0.05、0.23±0.04和0.62±0.15，miR-424表達(dá)組2-ΔΔCt值顯著高于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)，空白對照和陰性對照組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2miR-424表達(dá)對肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響 空白對照組、陰性對照組和miR-424表達(dá)組克隆形成率分別為(37.42±6.12)%、(36.83±6.14)%和(12.26±2.04)%，miR-424表達(dá)組克隆形成率顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)，空白對照組和陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 肝癌HepG2細(xì)胞增殖的平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

2.3miR-424表達(dá)對肝癌HepG2細(xì)胞周期的影響 miR-424表達(dá)組HepG2細(xì)胞增殖主要停滯在G1期，G1期細(xì)胞比例顯著高于空白對照組和陰性對照組，S期和G2期細(xì)胞比例顯著低于空白對照組和陰性對照組(P<0.05)，空白對照組和陰性對照組間G1、S和G2期細(xì)胞比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2和表1。

圖2 3組肝癌HepG2細(xì)胞周期的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果

表1 3組肝癌HepG2細(xì)胞周期分布

注：與空白對照組比較，aP<0.05；與陰性對照組比較，cP<0.05

2.4miR-424表達(dá)對肝癌HepG2細(xì)胞侵襲能力的影響 空白對照組、陰性對照組和miR-424表達(dá)組穿過Transwell小室細(xì)胞數(shù)分別為284.35±37.46、272.83±37.33和82.46±20.13，miR-424表達(dá)組穿過Transwell小室細(xì)胞數(shù)低于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)，空白對照組和陰性對照組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 3組肝癌HepG2細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(結(jié)晶紫染色×200)

3 討論

原發(fā)性肝癌是全球男性癌癥死亡的主要原因之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前仍未闡明。近年來，miRNA在肝癌中的作用受到學(xué)者們的關(guān)注，并有作為分子標(biāo)記物或治療靶點(diǎn)的趨勢[4]。miR-424在細(xì)胞周期、增殖、凋亡及存活等過程中有重要作用，劉明輝等[5]研究顯示，在胃癌SGC-7901細(xì)胞中過表達(dá)miR-424，可以上調(diào)自噬相關(guān)蛋白Beclin1，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生，抑制細(xì)胞增殖活力。Li等[6]研究顯示，抑制miR-424后，可以顯著促進(jìn)卵巢癌的增殖和遷移能力。林琳等[7]發(fā)現(xiàn)miR-424可以通過上調(diào)Rspo3基因，促進(jìn)人結(jié)腸癌Lovo細(xì)胞增殖。Wang等[8]研究顯示，長鏈RNA LINC00511可以通過下調(diào)miR-424促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，且與患者的預(yù)后密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，肝癌HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-424，腫瘤細(xì)胞克隆形成能力得到了抑制，細(xì)胞的增殖主要阻滯在G1期，提示miR-424在肝癌中發(fā)揮抑癌作用。Shekhar等[9]報(bào)道，miR-424通過下調(diào)細(xì)胞周期素A2表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞周期增殖。

侵襲能力決定患者預(yù)后。Wu等[10]報(bào)道，miR-424在膽管癌細(xì)胞遷移和間變中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，肝癌HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-424后，穿過Transwell小室細(xì)胞數(shù)低于空白對照組，提示升高miR-424后腫瘤細(xì)胞侵襲遷移能力得到抑制。

綜上所述，過表達(dá)miR-424可抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖和侵襲能力，有望成為肝癌防治分子靶點(diǎn)。