倪晨明 鄭楷煉 潘亞奇 倪燦榮 金鋼

1海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院胰腺外科，上海 200433；2海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院病理科，上海 200433

胰腺癌為早期癥狀隱匿、療效不佳、預后極差的高度惡性腫瘤，我國胰腺癌患者約占惡性腫瘤病例數(shù)的2.42%，且發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，嚴重威脅著患者的生命安全[1]，因此深入研究胰腺癌的發(fā)病機制，有助于胰腺癌早期診斷、延緩腫瘤發(fā)展和為治療提供精準化靶點。三結構域蛋白 14(tripartite motif 14，TRIM14)與腫瘤的生物學行為和臨床病理特征之間存在密切的關系，在腫瘤的血管生成和癌細胞轉移及凋亡抵抗中起到關鍵作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)TRIM14可顯著激活NF-κB信號通路[4-5]，而NF-κB信號通路為胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的關鍵核心途徑[6]。目前TRIM4在胰腺癌中的表達意義尚不明確，其表達與NF-κB信號通路活化關系也不清楚。本研究通過檢測胰腺癌組織TRIM14、磷酸化p65(phosphorylation p65, P-p65)及NF-κB靶基因Bcl-xl、CCND1、血管內皮細胞生長因子-C(vascular endothelial growth factor-C, VEGF-C)的表達，分析TRIM14與NF-κB的關系，探討TRIM14在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制。

資料與方法

一、臨床資料及組織標本

收集2016年1月至2018年12月間海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院胰腺外科176例行手術切除且病理確診的胰腺癌患者癌組織及其對應的癌旁組織(距離病灶3 cm處的正常胰腺組織)標本。其中男性95例，女性81例，年齡42～73歲，平均63歲。參考美國國立綜合癌癥網(wǎng)2011年中文版胰腺癌指南中TNM分期標準，Ⅰ期41例、Ⅱ期83例、Ⅲ期52例；根據(jù)病理分級，低分化46例、中分化79例、高分化51例。納入患者術前均無放療、化療、生物治療等治療史，患者及家屬均簽署知情同意書。術后通過定期門診復診或電話隨訪獲取病例的復發(fā)時間及總生存時間，隨訪時間截至2019年5月。176例胰腺癌及對應癌旁組織經手術切除后，置于4%甲醛溶液固定并石蠟包埋備用，其中12例手術切除后迅速放入液氮凍存。

二、胰腺癌及對應癌旁組織TRIM14蛋白表達檢測

組織石蠟標本制作成4 μm切片，采用免疫組織化學染色法檢測組織TRIM14蛋白表達，按試劑盒說明書操作。兔抗人TRIM14多克隆抗體購于英國abcam公司，工作濃度1∶1 000；多聚物抗兔、鼠IgG-HRP二抗購于北京中杉金橋公司，工作濃度1∶5 000，最后DAB顯色，蘇木素復染。以已知陽性的人肝組織為陽性對照，用PBS代替一抗為陰性對照，以胞質內出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達。由兩位病理科醫(yī)師分別鏡下閱片，針對TRIM14染色強度及范圍進行評分[5]。染色強度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。染色范圍評分：<5%為0分，5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。兩項評分的乘積為總評分，1～3分為弱陽性，4～7分為中度陽性組，8分及以上為強陽性[7]。

三、胰腺癌組織TRIM14、P-p65蛋白表達檢測

取液氮凍存胰腺癌組織50 mg，碾磨成粉末狀，使用RIPA裂解液裂解組織，抽提總蛋白。采用BCA試劑盒定量蛋白后常規(guī)行蛋白質印跡法檢測TRIM14、P-p65表達水平。小鼠抗人P-p65、小鼠抗人p65及小鼠抗人β-actin單克隆抗體均購自Cell Signal公司，工作濃度為1∶1 000，TRIM14一抗、二抗及其工作濃度同上。最后ECL發(fā)光，X片曝光、顯影、定影。應用Bio-Rad 公司的全自動凝膠成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶，以目的條帶與內參(β-actin)條帶的灰度值比表示蛋白相對表達量。

四、胰腺癌組織Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA表達檢測

取液氮凍存胰腺癌組織，解凍后采用Trizol提取組織總RNA，紫外分光光度儀法測定RNA純度及濃度。先將RNA逆轉錄為cDNA，按反轉錄試劑盒說明書操作。再用熒光定量PCR法檢測組織Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA表達，熒光定量試劑盒購自大連TaKaRa公司。Bcl-xl正向引物為5′-GAGCTGGTGGTTGACTTTCTC-3′，反向引物為5′-TCCATCTCCGATTCGTCCCT-3′；CCND1正向引物為5′-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′，反向引物為5′-CCCCTTCGCACACATTTGAA-3′；VEGF-C正向引物為5′-GAGGAGCAGTTACGGTCTGTG-3′，反向引物為5′-TCCTTTCCTTAGCTGACACTTGT-3′。以β-actin作為內參。所有引物由上海生工生物工程技術服務有限公司設計并合成。PCR反應條件：94℃ 5 min， 94℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 30 s，30個循環(huán)，72℃延伸5 min，4℃ 5 min。由PCR儀自帶軟件獲取Ct值，按公式2-△△Ct計算目的基因mRNA表達量。

五、統(tǒng)計學處理

結 果

一、胰腺癌組織TRIM14蛋白表達

TRIM14蛋白主要定位于胞質中(圖1)。176例癌組織中TRIM14蛋白表達陰性23例(13.1%)，弱陽性39例(22.2%)，中度陽性73例(41.4%)，強陽性41例(23.3%)；癌旁組織分別為128例(72.7%)、26例(14.8%)、17例(9.7%)、5例(2.8%)。胰腺癌組織TRIM14蛋白表達總陽性率為86.9%，顯著高于癌旁組織的27.3%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=127.846，P=0.000)。

二、胰腺癌組織TRIM14表達水平與腫瘤臨床病理參數(shù)的關系

將TRIM14陰性和弱陽性表達患者歸為低表達組，中度陽性和強陽性表達患者歸為高表達組。結果顯示，胰腺癌組織TRIM14表達水平與患者的臨床分期、淋巴結轉移及浸潤深度均呈顯著相關，而與患者性別、年齡、腫瘤分化程度及遠處轉移無明顯相關性(表1)。

注：TRIM14為三結構域蛋白14圖1 胰腺癌(1A)及癌旁組織(1B)TRIM14蛋白表達(免疫組織化學染色 × 200)

表1胰腺癌組織TRIM14表達水平與腫瘤臨床病理參數(shù)的關系(例)

臨床病理參數(shù)TRIM14蛋白表達低表達組(62例)高表達組(114例)χ2值P值性別 男35600.2360.372 女2754年齡(歲) ≤6529362.1240.998 >653366分化程度 高17340.1420.931 中2851 低1729臨床分期 Ⅰ期291235.7040.000 Ⅱ期2756 Ⅲ期646浸潤深度 T1201865.7600.000 T21720 T31532 T41044遠處轉移 無53940.2680.386 有920淋巴結轉移 無30364.8410.021 有3278

注：TRIM14為三結構域蛋白14

三、胰腺癌組織TRIM14表達水平與患者預后間的關系

單因素分析結果顯示，影響胰腺癌患者無瘤生存期的因素包括腫瘤分化程度、有無淋巴結轉移及TRIM14表達水平，影響總生存期的因素包括腫瘤分化程度、臨床分期、遠處轉移及TRIM14表達水平(P值均<0.05，表2)。多因素分析結果顯示，影響胰腺癌患者無瘤生存期的因素包括腫瘤分化程度和TRIM14表達水平，影響總生存期的因素包括腫瘤遠處轉移及TRIM14表達水平(表2)。由此可見，TRIM14蛋白高表達是胰腺癌患者無瘤生存期和總生存期的獨立危險因素。

四、TRIM14表達水平與NF-κB信號通路活化的關系

12例胰腺癌組織TRIM14、P-p65/p65比值及Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA表達水平見表3。胰腺癌組織TRIM14與P-p65表達的變化趨勢較為一致(r=0.86，P<0.01，圖2A)，即高表達TRIM14的胰腺癌組織的p65磷酸化程度也較高，提示NF-κB激活。胰腺癌組織NF-κB靶基因Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA表達水平也與TRIM14表達有較高的一致性(r值分別為0.85、0.91、0.92，P值均<0.01，圖2B)，進一步表明TRIM14高表達與癌細胞NF-κB激活有明顯關系。

討 論

近年來研究報道指出，TRIM家族在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。TRIM14基因為其家族成員之一，定位在人的9q22號染色體上，蛋白結構包括1個卷曲螺旋域、1個B-box結構域和1個C端PRYSPRY結構域。Zhuang等[8]研究指出TRIM14過表達可加速細胞周期，通過PI3K/AKT信號通路影響細胞的有絲分裂過程。杜天明等[9]研究發(fā)現(xiàn)TRIM14在胃癌組織高表達，可能參與胃癌惡化的過程。白明輝等[10]發(fā)現(xiàn)TRIM14在胰腺癌組織中也高表達，且與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展及癌細胞侵襲能力之間有著密切關系，TRIM14表達水平越高，患者的預后越差。本研究結果顯示，TRIM14在胰腺癌組織高表達，與上述報道基本相符。進一步分析TRIM14表達水平與胰腺癌患者臨床病理特征之間的關系，結果顯示，TRIM14表達水平與腫瘤臨床分期、浸潤深度和淋巴結轉移等惡性病理特征顯著相關，提示 TRIM14可能參與了胰腺癌細胞遷移和侵襲能力的調控。Cox回歸分析結果顯示，影響胰腺癌患者無瘤生存期的因素包括腫瘤的分化程度和TRIM14的表達水平，影響總生存期的因素包括腫瘤遠處轉移及TRIM14的表達水平，可見TRIM14高表達是胰腺癌患者無瘤生存期和總生存期的獨立危險因素。

表2 與胰腺癌患者無瘤生存期和總生存期相關風險因素的分析

注：TRIM14為三結構域蛋白14

表3 12例胰腺癌組織TRIM14、P-p65/p65比值及Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA的表達水平

注：TRIM14為三結構域蛋白14；P-p65為磷酸化p65；Bcl-xl、CCND1為細胞核因子-kappaB靶基因；VEGF-C為血管內皮生長因子-C

注：TRIM14為三結構域蛋白14；P-p65為磷酸化p65；Bcl-xl、CCND1為細胞核因子-kappaB靶基因；VEGF-C為血管內皮生長因子-C

圖212例胰腺癌組織TRIM14表達水平與P-p65/p65比值(2A)及Bcl-xl、CCND1、VEGF-C mRNA表達水平(2B)的相關性

TRIM14在腫瘤發(fā)生中的作用機制報道較少， Su等[4]研究發(fā)現(xiàn)，過表達TRIM14可通過激活NF-κB信號通路增強細胞的侵襲性。本研究發(fā)現(xiàn)，TRIM14表達水平與NF-κB信號通路激活狀態(tài)呈正相關，提示TRIM14可能通過活化NF-κB信號通路促進癌癥發(fā)生。進一步的調控機制尚需在體外細胞實驗中得到驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突