林金海 陳曉佳 丁友玲

摘 要 目的：建立注射用鹽酸溴己新原料中細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)方法。方法：對(duì)鹽酸溴己新原料預(yù)處理后再進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)，并依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中的干擾實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)處理方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：預(yù)處理并稀釋160倍后的鹽酸溴己新原料對(duì)鱟試劑（λ=0.06 EU/ml）無(wú)干擾作用。結(jié)論：所建立的注射用鹽酸溴己新原料中細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法是可行的。

關(guān)鍵詞 細(xì)菌內(nèi)毒素 鹽酸溴己新 干擾實(shí)驗(yàn)

中圖分類號(hào)：R927.12； R974.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2020）07-0075-03

Study on the bacterial endotoxin test in the raw material of bromhexine hydrochloride for injection*

LIN Jinhai， CHEN Xiaojia， DING Youling**

（Fuzhou Xinbei Biochemical Industrial Co.， Ltd.， Fuzhou 350101， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the bacterial endotoxin test in the raw material of bromhexine hydrochloride for injection. Methods： The raw material of bromhexine hydrochloride for injection was pretreated and then bacterial endotoxin test was performed. The method was verified based on the interference experiment in the bacterial endotoxin test section of Chinese Pharmacopoeia 2015 Edition. Results： There was no interference on tachypleus amebocyte lysate （λ=0.06 EU/ml）after it was pretreated and diluted by 160 times. Conclusion： The established method can be used for the bacterial endotoxin test in the raw material of bromhexine hydrochloride for injection.

KEy WORDS bacterial endotoxin； bromhexine hydrochloride； interference experiment

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法要求實(shí)驗(yàn)樣品溶液pH控制在6～8[1]。鹽酸溴己新（bromhexine hydrochloride）在乙醇中微溶，在水中極微溶解[2]。乙醇助溶后的鹽酸溴己新溶液（1 mg/ml）pH<4，為了檢測(cè)鹽酸溴己新原料中的細(xì)菌內(nèi)毒素，筆者采用加堿性調(diào)節(jié)劑（pH=7.8的TrisHCl緩沖溶液）調(diào)節(jié)pH至7.5左右，再稀釋至160倍，使之適用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則“1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”中“干擾實(shí)驗(yàn)”的要求，對(duì)本預(yù)處理進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料及儀器

1.1 材料和試劑

鱟試劑（TAL）（批號(hào)：18051312，規(guī)格：0.1 ml/支，標(biāo)示靈敏度：0.06 EU/ml），細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（批號(hào)：18033121，規(guī)格：100 ml/瓶），pH調(diào)節(jié)劑（堿性）（批號(hào)：180301，pH為7.8～8.2，規(guī)格：2 ml/支），以上試劑均為福州新北生化工業(yè)有限公司生產(chǎn)。

細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：150800-201601，規(guī)格：1 ml/支，效價(jià)：9 000 EU/支）。無(wú)水乙醇（西隴科學(xué)股份有限公司，批號(hào)：17120102，分析純）。注射用鹽酸溴己新原料（江西億友藥業(yè)有限公司，細(xì)菌內(nèi)毒素限值<10 EU/mg）。

1.2 儀器

FA2204B電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；XMTD-7000電熱恒溫水溫箱（上海科恒實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；ZH-2混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)

2.1.1 鱟試劑靈敏度（λ）的復(fù)核

依照《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”，對(duì)選用的鱟試劑進(jìn)行靈敏度復(fù)核試驗(yàn)，實(shí)測(cè)靈敏度（λc）=antilg（∑X/4），式中X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg），結(jié)果見表1。

由表1可見，鱟試劑（批號(hào)：18051312）的實(shí)測(cè)靈敏度（λc）為0.06 EU/ml，符合在0.5～2λ范圍內(nèi)的要求。

2.1.2 鹽酸溴己新原料預(yù)處理

鹽酸溴己新原料于100～105 ℃[3]下干燥5 h，取出置干燥器中降溫30 min，獲得鹽酸溴己新原料干燥品。精密稱定鹽酸溴己新原料干燥品，加無(wú)水乙醇溶解，在漩渦混合器中混合9 min，制成1 mg/ml的鹽酸溴己新溶液，即為供試品原液，備用。

2.1.3 鹽酸溴己新溶液干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)

供試品陰性對(duì)照（NPC）：供試品原液加等體積細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，稀釋至2倍，再加入等體積的堿性調(diào)節(jié)劑（pH=7.8的Tris-HCl緩沖溶液），稀釋至4倍。用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水進(jìn)一步稀釋，制成稀釋20倍、40倍、80倍、160倍、320倍這5個(gè)連續(xù)稀釋倍數(shù)的溶液，作為NPC。

供試品陽(yáng)性對(duì)照（PPC）：在上述5個(gè)NPC中加入細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使每個(gè)均含有2λ的細(xì)菌內(nèi)毒素，作為PPC。

陽(yáng)性對(duì)照（PC）：細(xì)菌內(nèi)毒素濃度為0.125 EU/ml的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。

陰性對(duì)照（NC）：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。

選用鱟試劑（批號(hào)：18051312，λ=0.06 EU/ml）進(jìn)

行干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

由表2可見，1 mg/ml的鹽酸溴己新溶液稀釋≥80倍時(shí)，對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查實(shí)驗(yàn)無(wú)干擾。為了有效避免干擾，本研究選用供試品原液稀釋160倍進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。

2.2 鹽酸溴己新溶液干擾實(shí)驗(yàn)

取供試品原液（1 mg/ml）按干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)處理方法稀釋160倍，選用鱟試劑（批號(hào)18051312，λ=0.06 EU/ml），依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則“1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

由表3可見，Es/Et在0.5～2.0間，表明1 mg/ml鹽酸溴己新乙醇溶液按預(yù)實(shí)驗(yàn)處理（稀釋160倍）對(duì)鱟試劑（λ=0.06 EU/ml）無(wú)干擾作用。

2.3 注射用鹽酸溴己新原料的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

1 mg/ml的鹽酸溴己新乙醇溶液調(diào)節(jié)pH后，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋160倍。按照《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則1143“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查（鱟試劑λ=0.06 EU/ml）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：陽(yáng)性對(duì)照、供試品陽(yáng)性對(duì)照均為陽(yáng)性；陰性對(duì)照、供試品陰性對(duì)照均為陰性。說(shuō)明該批次注射用鹽酸溴己新原料（細(xì)菌內(nèi)毒素限值<10 EU/mg）稀釋160倍，選用鱟試劑（λ=0.06 EU/ml）進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，原料細(xì)菌內(nèi)毒素含量符合要求。

3 結(jié)論

《中華人民共和國(guó)藥典》中“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法”代替兔法已應(yīng)用于500多種藥品或原料藥細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)。但是，對(duì)某些注射用藥品及原料在進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查時(shí)，需要排除干擾因素，以適應(yīng)用鱟試劑檢測(cè)細(xì)菌內(nèi)毒素時(shí)所需的基本條件[4]。往往在樣品檢測(cè)前需加入二價(jià)陽(yáng)離子調(diào)節(jié)劑、堿性或酸性調(diào)節(jié)劑，或者采用稀釋法來(lái)消除樣品對(duì)鱟試劑的干擾[5-9]。由于注射用鹽酸溴己新原料是難溶物質(zhì)，本研究采用乙醇溶解鹽酸溴己新原料，再加堿性調(diào)節(jié)劑（pH=7.8的Tris-HCl緩沖溶液）調(diào)節(jié)pH的預(yù)處理方法，再根據(jù)它的內(nèi)毒素限值選用鱟試劑（λ=0.06 EU/ml）、稀釋倍數(shù)160倍，證明對(duì)檢測(cè)鹽酸溴己新原料中的細(xì)菌內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)無(wú)干擾。

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