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高效液相色譜法測(cè)定鐵皮石斛花中總黃酮的含量

2020-04-27 06:25:16農(nóng)彥彥吳子瑜林詩堃李佳璐馮才敏
關(guān)鍵詞:樣量鐵皮蘆丁

農(nóng)彥彥,吳子瑜,林詩堃,黃 敏,李佳璐,馮才敏

(順德職業(yè)技術(shù)學(xué)院 輕化與材料學(xué)院,廣東 佛山 528333)

鐵皮石斛為蘭科植物,是以熱帶東南亞為中心向亞熱帶性氣候條件發(fā)展的一類植物[1]。鐵皮石斛一直與靈芝、人參和冬蟲夏草等被列為上品中藥,具有清肝明目、益胃生津[2]、滋陰清熱、潤肺止咳等功效[3]。目前,石斛屬植物的研究主要集中在藥用部位莖,關(guān)于石斛花的研究相對(duì)較少。前期研究發(fā)現(xiàn)[4-7],鐵皮石斛花含有大量的黃酮類化合物與有機(jī)酸類、萜類等資源性成分,這些成分具有較強(qiáng)的生物活性,具有抗氧化、抗衰老、抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫的功效。隨著石斛種植面積的不斷擴(kuò)大,石斛花資源也不斷豐富,越來越多的茶商收購石斛花將其開發(fā)成保健品花茶飲用,石斛花制成的花茶口感清香、柔滑,具有清新解郁、緩解精神壓力、潤膚養(yǎng)顏等多種功效[8-10]。蘆丁為石斛花中的主要黃酮類物質(zhì),本試驗(yàn)通過探討石斛花中蘆丁含量的測(cè)定,建立石斛花活性成分(蘆?。┑腍PLC 的分析方法,為石斛花的產(chǎn)業(yè)開發(fā)提供參考,也為擴(kuò)大石斛藥材藥用部位提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

供試石斛花樣品由順德職業(yè)技術(shù)學(xué)院石斛組織培養(yǎng)課題組提供。

1.2 儀器與試劑

Agilent1260 高效液相色譜系統(tǒng)(二極管陣列檢測(cè)器);LE204E/02 分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);KQ-500 型 高頻數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);A11 basic 分析研磨機(jī)(德國IKA);Express 40 超純水機(jī)(MILLIPORE)

蘆丁對(duì)照品(純度:95%,批號(hào):Lot#B1911032,Aladdin);甲醇(色譜純);乙酸(優(yōu)級(jí)純)。

1.3 溶液制備

1)對(duì)照品溶液的制備。

取蘆丁對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL 含0.1 mg 的溶液。

2)供試品溶液的制備。

取供試品粗粉1.000 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加人甲醇50 mL,稱定重量,超聲處理(功率250 W,頻率25 kHz)30 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,過濾。

1.4 色譜條件

色譜柱為Agilent-C18 柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫30 ℃,流動(dòng)相甲醇∶0.5%乙酸(V/V)為38∶62,流速1 mL/min,進(jìn)樣量 5 μL,檢測(cè)波長385 nm。理論板數(shù)按蘆丁計(jì)算,不應(yīng)低于2 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)波長的選擇

采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)波長進(jìn)行掃描,取蘆丁對(duì)照品溶液,在200~800 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描,測(cè)得最佳吸收波長為358 nm。此波長處吸收較大,干擾較小。因此,選擇358 nm 作為檢測(cè)波長。

2.2 流動(dòng)相的選擇

分別以甲醇-水溶液,甲醇-0.5%磷酸水溶液,甲醇-0.5%乙酸水溶液作為流動(dòng)相,同時(shí)以甲醇-0.5%乙酸水溶液不同配比對(duì)蘆丁對(duì)照品溶液和樣品溶液進(jìn)行測(cè)定。如圖1 所示,甲醇-0.5%乙酸水溶液的色譜峰分離效果較好,其中甲醇:0.5%乙酸水溶液=38∶62 配比靈敏度高,峰型平整,分離效果較好。

圖1 不同流動(dòng)相種類對(duì)比圖譜

2.3 流速的選擇

高效液相色譜流速過高,不利于儀器和色譜柱的保護(hù);流速過低,使目標(biāo)色譜峰的出峰時(shí)間延長,拉伸峰型,本實(shí)驗(yàn)以改變流速對(duì)蘆丁對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖2 所示,綜合考慮對(duì)色譜柱的保護(hù)和峰型的平整,試驗(yàn)選擇流速為1.1 mL/min。

2.4 進(jìn)樣量的選擇

進(jìn)樣量的高低取決了樣品的峰面積、保留時(shí)間和峰型的平整,本方法分別將自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣量調(diào)為3 μL,5 μL,10 μL,15 μL,20 μL,對(duì)蘆丁對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖3 所示,綜合考慮峰面積、保留時(shí)間和峰型,5 μL 進(jìn)樣量為最佳。

圖2 不同流速對(duì)比圖譜

圖3 不同進(jìn)樣量對(duì)比圖譜

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

1)方法專屬性試驗(yàn)。

分別取蘆丁對(duì)照品溶液、供試品溶液進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見圖4 圖5。

圖4 蘆丁對(duì)照品譜圖

圖5 供試品譜圖

2)線性關(guān)系。

取蘆丁對(duì)照品溶液,將自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣量分別調(diào)為0.4 μL、0.8 μL、1.2 μL、1.6 μL、2.0 μL,以峰面積(A)為縱坐標(biāo),以蘆丁質(zhì)量(ng)為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程。如圖6 所示,表明蘆丁在0.04~0.2μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖6 蘆丁對(duì)照品標(biāo)曲線

3)精密度。

取對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5 次,結(jié)果見圖7,可表明該方法下儀器精密度良好。

圖7 對(duì)照品重現(xiàn)性

4)重復(fù)性。

取鐵皮石斛花供試品溶液6 份,進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見圖8,表明該方法下樣品測(cè)定的重復(fù)性好。

圖8 樣品重現(xiàn)性

5)回收率。

精密量取鐵皮石斛花供試樣品液6 份,每份0.5 mL,分別精密加入蘆丁對(duì)照品溶液0.5 mL,混勻,進(jìn)樣測(cè)定,每份測(cè)定2 次,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見表1,由表可知,平均加樣回收率為 99.38%,該方法測(cè)定樣品準(zhǔn)確度較高。

表1 回收率

2.5 供試品測(cè)定

供試品溶液測(cè)定鐵皮石斛花微花期和盛花期總黃酮含量,由表2 顯示,微花期中總黃酮含量比盛花期總黃酮含量高。

表2 供試品測(cè)定

3 結(jié)論

建立高效液相色譜法測(cè)定鐵皮石斛花中總黃酮含量(以蘆丁計(jì))的方法,蘆丁色譜峰峰形對(duì)稱,在濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,平均加樣回收率、精密度、重復(fù)性均符合含量測(cè)定的要求。

試驗(yàn)建立的HPLC 方法靈敏度高,專屬性強(qiáng),重現(xiàn)性好,適合鐵皮石斛花中總黃酮含量(以蘆丁計(jì))的測(cè)定。同時(shí),試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)微花期鐵皮石斛的黃酮含量比盛花期鐵皮石斛黃酮含量高,為石斛花資源開發(fā)利用和產(chǎn)品加工提供了參考依據(jù)。

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