謝玉清，陳 競，代金平，楊新平，古麗努爾·艾合買提，王志方，王小武，馮 蕾*

1新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所；2新疆特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830091

漆酶最早于1883 年在漆樹的汁液中發(fā)現(xiàn)，后來研究表明漆酶廣泛存在于自然界中，如植物、真菌、細(xì)菌、動(dòng)物及昆蟲中[1]。漆酶屬于藍(lán)色氧化酶家族，是一種含銅的多酚氧化酶，以分子氧作為最終電子受體，是重要的木質(zhì)纖維降解酶之一，還能催化降解多種芳香族化合物,特別是酚類[2]。因而漆酶作為一種綠色生物催化劑在生物質(zhì)能源、紙漿生物漂白、染料脫色、廢水處理、食品加工等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[3]。

真菌漆酶比細(xì)菌漆酶、植物漆酶等具有更好的熱穩(wěn)定性、金屬離子耐受性及更高的底物催化氧化性，在工農(nóng)業(yè)及環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用中得到了較高的關(guān)注[4]。木蹄層孔菌屬擔(dān)子菌綱的白腐菌目，是漆酶最主要的生產(chǎn)者之一[5]。真菌漆酶的生產(chǎn)模式包括固態(tài)發(fā)酵和液體發(fā)酵，工業(yè)生產(chǎn)基本以液體發(fā)酵為主，而高酶活發(fā)酵工藝的優(yōu)化及漆酶穩(wěn)定性的研究是工業(yè)化生產(chǎn)漆酶的關(guān)鍵[6]。本研究對新疆阿勒泰山區(qū)分離篩選到的一株木蹄層孔菌(Fomesfomentarius)SO3菌產(chǎn)漆酶的發(fā)酵條件及部分酶學(xué)特性進(jìn)行研究，為真菌漆酶的規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

木蹄層孔菌(Fomesfomentarius)SO3為本實(shí)驗(yàn)室從采自新疆阿勒泰山的菌種中分離篩選獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基

產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基MF[7-9]：麥麩25 g，葡萄糖10 g，酒石酸銨1.84 g，NaCl 1.0 g、KH2PO42 g，琥珀酸鈉1.18 g， VB110 mg，聚山梨酯-80 0.5 g，微量元素溶液70 mL，加水定容至1 000 mL，pH調(diào)至5.5。

微量元素組成：MgSO4·7H2O 3.0 g，MnSO4·H2O0.5 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，CuSO4·7H2O 0.1 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，KAl(SO4)2·12H2O 10 mg，H3BO310 mg，NaMnO4·2H2O 10 mg，加水定容至1 000 mL。

1.1.3 酶檢測試劑

0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 4.0)，0.5 mmol/L 2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，漆酶(laccase)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 漆酶活力測定

采用ABTS[2，2-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)]法[10-12]。反應(yīng)體系組成為:0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖液(pH4.0)1.95 mL、0.5 mmol/L 連氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)2.00 mL和適當(dāng)稀釋的酶液50 μL， 28 ℃啟動(dòng)反應(yīng)。并在3 min內(nèi)連續(xù)測定反應(yīng)液420 nm(ε=3.6×104mol/L/cm)處吸光值的增加值。該條件下，每分鐘使1 μmol/L的ABTS氧化所需的酶量定義為1個(gè)活力單位(U)。

漆酶活力計(jì)算公式：漆酶活力(U/L)=(n×△A×106×V1)/(3.6×104×3×V2)

其中：n為酶液稀釋倍數(shù)；V1為反應(yīng)總體積；V2為反應(yīng)酶液體積；△A為3 min內(nèi)反應(yīng)液在420 nm處吸光度的變化值；3.6×104為ABTS氧化態(tài)的摩爾吸光系數(shù)(mol/L/cm)。

1.2.2 產(chǎn)漆酶發(fā)酵條件的研究

1.2.2.1 不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)[13]，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基MF的基礎(chǔ)上進(jìn)行碳源替換，分別以0.5%的麥芽糖、蔗糖、甘油、葡萄糖、羧甲基纖維素鈉、淀粉、麥麩作為碳源，裝液量50 mL/瓶，種子菌齡為5天，接種量5%，pH調(diào)至5.5，發(fā)酵7天后檢測漆酶活性。

1.2.2.2 不同氮源對發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基MF的基礎(chǔ)上進(jìn)行氮源替換，分別以0.5%干酪素、酵母粉、蛋白胨、硝酸銨、硫酸銨、磷酸二氫銨、酒石酸銨作為氮源，裝液量50 mL/瓶，種子菌齡為5天，接種量5%，pH調(diào)至5.5，發(fā)酵7天后檢測漆酶活性。

1.2.2.3 不同金屬離子添加對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

以MF為產(chǎn)漆酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加濃度為0、0.1、0.5、1.0、2.0 mmol/L的Cu2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Co2+，培養(yǎng)6天，測定漆酶的活性(U/L)。

1.2.2.4 不同誘導(dǎo)劑對漆酶活性的影響[14]

以MF為基礎(chǔ)產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基，pH調(diào)至5.5，裝液量50 mL/瓶，種子菌齡為5天，接種量5%，接種后第二天添加不同誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)劑分別為藜蘆醇、ABTS、沒食子酸、單寧酸及愈創(chuàng)木酚，終濃度為0.025 mmol/L。分別在第3、5、7、9、11天測定酶活。

1.2.2.5 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基

在MF基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，各選擇兩種最優(yōu)的碳、氮源進(jìn)行組合，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，選用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，具體組合如表1。

表1 培養(yǎng)基組成因素水平表

1.2.3 漆酶部分酶學(xué)特性研究

1.2.3.1 SO3漆酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

在pH4.0的NaAc-HAc緩沖液中，在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，分別在20、30、40、50、60、70、80 ℃條件下測定酶活，設(shè)定在50 ℃條件下測定的SO3漆酶活性為100%，確定漆酶最適反應(yīng)溫度；在上述不同反應(yīng)溫度下繼續(xù)保溫10 min后，再次測定漆酶活性，以反應(yīng)起始的酶活為對照，計(jì)算殘留酶活，確定其熱穩(wěn)定性。

1.2.3.2 SO3漆酶的最適反應(yīng)pH

分別用pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制反應(yīng)底物，測定漆酶活力。

1.2.3.3 SO3漆酶pH穩(wěn)定性

將酶液加入pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制的底物，放入40 ℃的水浴中保溫24 h，測定酶活。

1.2.3.4 不同金屬離子對SO3漆酶穩(wěn)定性的影響

用pH4.0的NaAc-HAc緩沖液配制FeCl2、MnSO4、NaCl、CoCl2、ZnSO4、CaCl2、MgSO4、CuSO4、KCl、CdCl2、CrCl3、PbCl2、AgNO3、BaSO4溶液，使其終濃度為4 mmol/L，在最適反應(yīng)溫度下，以不添加上述金屬離子的反應(yīng)體系作為對照，計(jì)算漆酶的相對活力。

1.2.4 SO3漆酶蛋白性質(zhì)研究

1.2.4.1 SO3分泌蛋白SDS-PAGE分析

按最優(yōu)的發(fā)酵條件獲得漆酶發(fā)酵液，10 000 rpm、4 ℃、離心20 min，經(jīng)過了30%～80%的硫酸銨分段鹽析、Macro-Prep DEAE弱陰離子交換層析和Bio-Gel P-60 凝膠過濾層析系列純化，純化產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析[15]。

1.2.4.2 SO3分泌蛋白雙向電泳、漆酶等電點(diǎn)測定及主要蛋白質(zhì)譜分析[16]

采用Bio-Rad蛋白質(zhì)雙向電泳系統(tǒng)測定木蹄層孔菌(F.fomentarius)SO3漆酶的等電點(diǎn)，將漆酶發(fā)酵液經(jīng)過10 000 rpm、4 ℃、離心20 min后，分別收集上清液和沉淀，使用pH7.5、20 mmol/L的Tris·HCl緩沖液將沉淀沖洗4～5次，然后加入Tris·HCl緩沖液進(jìn)行超聲波破碎(冷卻進(jìn)行)后，10 000 rpm、4 ℃、離心10 min，取上清液進(jìn)行透析過夜、濃縮至所需體積即可。上清液則可直接進(jìn)行透析過夜、濃縮至所需體積。等電點(diǎn)聚焦使用了Bio-Rad的IPG預(yù)制膠條，pH為3.0～10，pH梯度為線性梯度，通過Bio-Rad PDQuest 2-D Analysis software軟件分析獲得酶蛋白等電點(diǎn)pI。第二向SDS-PAGE電泳對木蹄層孔菌(F.fomentarius)SO3發(fā)酵產(chǎn)酶高峰時(shí)的菌體及發(fā)酵液進(jìn)行上樣檢測對比分析。并將表達(dá)量高的漆酶蛋白點(diǎn)切下進(jìn)行質(zhì)譜測序分析(委托北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院完成)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)漆酶發(fā)酵條件的研究

2.1.1 不同碳源對SO3產(chǎn)漆酶的影響

基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基以麥麩加葡萄糖(CK)的碳源組合酶活相對較高，為10 966 U/L，麥麩產(chǎn)酶活性為1 326 U/L，麥芽糖產(chǎn)酶活為313 U/L；添加蔗糖、甘油、葡萄糖、羧甲基纖維素鈉、淀粉替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的麥麩加葡萄糖均未檢測到酶活(圖1)，由此確定基礎(chǔ)培養(yǎng)基MF中麥麩加葡萄糖的碳源組合為最佳。

圖1 不同C源對SO3產(chǎn)漆酶的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on the production of SO3 laccase注：1.麥芽糖；2.蔗糖；3.甘油；4.葡萄糖；5.羧甲基纖維素鈉；6.淀粉；7.麥麩；8.對照。Note:1.Maltose;2.Sucrose;3.Glycerin;4.Glucose;5.Carboxymethylcellulose sodium;6.Starch;7.Wheatbran;8.CK.

2.1.2 不同氮源對SO3產(chǎn)漆酶的影響

添加酵母粉替代原培養(yǎng)基中的酒石酸銨時(shí)，酶活最高，為7 566 U/L；其次為磷酸二氫銨，酶活為4 994 U/L；再次為蛋白胨，酶活為3 312 U/L；添加硝酸銨替代原培養(yǎng)基中的酒石酸銨時(shí)，酶活為1 224 U/L；添加硫酸銨和干酪素替代原培養(yǎng)基中的酒石酸銨時(shí)，酶活分別為1 155和1 080 U/L；而以酒石酸銨(CK)作為氮源時(shí)，酶活為1 113 U/L，由此確定，SO3產(chǎn)漆酶的最佳氮源為酵母粉，其次為(NH4)H2PO4(圖2)。

圖2 不同N源對SO3產(chǎn)漆酶的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on the production of SO3 laccase注：1.干酪素(0.5%)；2.酵母粉；3.蛋白胨；4.硝酸銨；5.硫酸銨；6.磷酸二氫銨(0.5%)；7.酒石酸銨。Note:1.Casein(0.5%);2.Yeast extract powder;3.Pepton;4.Ammonium nitrate;5.Ammonium sulfate;6.Ammonium dihydrogen phosphate;7.Ammonium tartrate(CK).

2.1.3 不同金屬離子濃度對產(chǎn)漆酶的影響

以不添加金屬離子組(0 mmol/L)為對照(圖3)， Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+的添加對SO3產(chǎn)漆酶有一定的促進(jìn)作用，其中0.1 mmol/L的Mg2+、0.1 mmol/L和2 mmol/L Zn2+、0.2 mmol/L和0.5 mmol/L Ca2+的效果最明顯。添加0.1 mmol/L的Mg2+在第7 d所測得的酶活由對照組的761 U/L增加至7 983 U/L， 0.1 mmol/L Zn2+在第7 d所測得的酶活由4 809 U/L增加到 9 870 U/L，Zn2+濃度在2 mmol/L時(shí)酶活由4 809 U/L 增加到9 774 U/L；Fe2+和Co2+的添加，漆酶產(chǎn)量較低，對產(chǎn)酶影響不明顯；不同濃度Cu2+的添加都使酶活明顯下降，說明Cu2+對產(chǎn)酶具有抑制作用。

2.1.4 不同誘導(dǎo)劑對SO3產(chǎn)漆酶的影響

由圖4可知，添加沒食子酸和單寧酸可使產(chǎn)酶高峰期由對照的第7天提前到第5天；添加ABTS可使酶活由6 736 U/L提高至8 470 U/L；而藜蘆醇抑制產(chǎn)酶，愈創(chuàng)木酚對產(chǎn)酶無明顯影響。

圖3 不同金屬離子添加對SO3產(chǎn)漆酶的影響Fig.3 Effect of different metallic ion

圖4 不同誘導(dǎo)劑對SO3產(chǎn)漆酶的影響Fig.4 Effect of different inducer

2.1.5 培養(yǎng)基的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從表2和表3的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析可知，因素A(酵母粉)的第二個(gè)水平最佳，因素B(麥麩)的第三個(gè)水平最佳，因素C(葡萄糖)和D(磷酸二氫銨)最佳水平分別是第一和第二。因此最優(yōu)培養(yǎng)基組分為A2B3C1D2，即酵母粉0.5%、麥麩2.5%、葡萄糖0.5%、磷酸二氫銨0.5%。極差(R)反映了不同因素對酶活影響的程度，其主次順序?yàn)锳(酵母粉)>D(磷酸二氫銨)>B(麥麩)>C(葡萄糖)。通過此培養(yǎng)基進(jìn)一步優(yōu)化后，木蹄層孔菌(Fomesfomentarius)SO3漆酶活性達(dá)到10 863 U/L。

2.2 漆酶部分酶學(xué)特性研究

2.2.1 SO3菌漆酶的最適反應(yīng)溫度

在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)定在50 ℃條件下測定的SO3漆酶活性為100%，20到80 ℃溫度區(qū)間內(nèi)測定的反應(yīng)液酶活分別為60.7%、79.6%、88.4%、100%、91%、98%、74%(圖5)。

2.2.2 SO3菌漆酶的熱穩(wěn)定性

SO3漆酶反應(yīng)液繼續(xù)保溫10 min后，對比相同溫度下起始酶活， 計(jì)算剩余酶活百分比，結(jié)果表明，40 ℃時(shí)穩(wěn)定性最好(圖6)。

表2 木蹄層孔菌(Fomes fomentarius)SO3 L9(34)產(chǎn)酶條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析表

圖5 SO3漆酶最適反應(yīng)溫度Fig.5 The optimum reaction temperature of SO3

圖6 SO3漆酶熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of SO3

2.2.3 SO3菌漆酶的最適反應(yīng)pH

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pH為2.0到3.0時(shí)所測定的酶活相對較高，pH為2.0時(shí)酶活為1 295 U/L，pH4.0時(shí)酶活為897 U/L，pH為6.0以上時(shí)所測酶活為0(圖7)。

圖7 SO3漆酶最適反應(yīng)pHFig.7 Effect of optimal pH on SO3 laccase

2.2.4 SO3菌漆酶pH穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，漆酶在40 ℃保溫24 h，pH4.0～5.0時(shí)酶活較穩(wěn)定，pH3.0時(shí)相對酶活為42.1%，pH4.0時(shí)為73.6%，pH5.0時(shí)，酶活達(dá)到最大為97.8%，隨著pH值的升高酶活逐漸降低，超過pH6.0時(shí)殘留酶活為0(圖8)。

圖8 SO3漆酶的pH穩(wěn)定性Fig.8 Effect of pH on SO3 laccase stability

2.2.5 不同金屬離子對漆酶穩(wěn)定性的影響

結(jié)果表明，Mn2+和Zn2+對酶穩(wěn)定性有一定的促進(jìn)作用，其中在含有Zn2+的pH4.0的NaAc-HAc緩沖液反應(yīng)體系中，所測酶活為955 U/L，為對照的102%，Mg2+、Cu2+、Ba2+酶穩(wěn)定影響不大；Co2+、Cd2+、Cr2+和Pb2+對酶的穩(wěn)定性具有明顯的破壞作用，其中加入Co2+時(shí)酶活為28%，Cd2+為47%，Pb2+為54%；而Fe2+對漆酶活性完全抑制(圖9)。

2.3 SO3漆酶蛋白性質(zhì)研究

2.3.1 不同純化步驟的SDS-PAGE電泳

SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖10所示，發(fā)酵培養(yǎng)基中含有多種蛋白及多肽，發(fā)酵液上清在61 KD左右有較明顯的蛋白帶，經(jīng)過離子交換層析后基本呈單一條帶，經(jīng)過凝膠過濾層析后，SDS-PAGE電泳顯示只有一條蛋白帶。通過一系列的蛋白分離純化實(shí)驗(yàn)，獲得的漆酶已經(jīng)達(dá)到了電泳純級(jí)。應(yīng)用Bio-RAD quantity one分析軟件[17]，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白相對分子量，得出木蹄層孔菌漆酶相對分子量約為61.5 KD。

圖9 不同金屬離子對SO3漆酶穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of different metal ion on SO3

圖10 菌株不同純化步驟的SDS-PAGE圖Fig.10 SDS-PAGE of purification steps of F.fomentarius 注：M.蛋白相對分子量標(biāo)樣；1.硫酸銨鹽析(60%)；2.離子交換層析；3.硫酸銨鹽析(80%)；4.凝膠過濾層析。Note:M.protein markers;1.Ammonium sulfate salting-out(60%);2.Ion-exchang chromatography;3.Ammonium sulfate salting-out(80%);4.Gel filtration chromatography.

2.3.2 木蹄層孔菌(F.fomentarius)SO3漆酶蛋白質(zhì)雙向電泳及等電點(diǎn)

分別將以木蹄層孔菌(F.fomentarius)SO3發(fā)酵產(chǎn)酶高峰時(shí)的菌體及發(fā)酵液蛋白樣品用pH為3.0-10范圍的IPG非線性膠條進(jìn)行等點(diǎn)聚焦，然后用12%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行第二向分離。結(jié)果表明，菌體蛋白檢測出較多蛋白質(zhì)點(diǎn)，而發(fā)酵液蛋白點(diǎn)則主要在同一等電點(diǎn)區(qū)域，通過Bio-Rad PDQuest 2-D Analysis software軟件分析，酶蛋白pI為4.1，將菌體及發(fā)酵液表達(dá)量高的同一蛋白質(zhì)點(diǎn)切下進(jìn)行質(zhì)譜分析。

圖11 木蹄層孔菌(F.fomentarius)SO3菌體及發(fā)酵液的蛋白質(zhì)雙向電泳Fig.11 Protein two-dimensional electrophoresis注：a.菌體；b.發(fā)酵液。Note:a.Ultrasonic disintegration sample cell;b.Upernatant of fermentation liquor.

2.3.3 木蹄層孔菌(F.fomentarius)SO3漆酶質(zhì)譜分析

對主要表達(dá)蛋白進(jìn)行MALDI TOF/TOF質(zhì)譜分析(圖11)，利用GPS Explor軟件進(jìn)行分析，MASCOT檢索NCBI Nr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，成功鑒定1個(gè)蛋白點(diǎn)(蛋白質(zhì)得分>50，可信度>90)(表4)，鑒定的蛋白為LaccaseE(Trametessp.420)，其肽脂紋圖譜中有8條序列均與LaccaseE蛋白匹配。

表4 木蹄層孔菌(F.fomentarius)SO3漆酶質(zhì)譜分析中基本信息和匹配的肽段序列

3 討論與結(jié)論

漆酶是一種分布廣泛的多酚氧化酶，在食品、能源和環(huán)保等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。木蹄層孔菌可以合成分泌包括漆酶在內(nèi)的多種木質(zhì)纖維素降解酶，這些酶的活性會(huì)隨著發(fā)酵工藝的不同而不同，所以對產(chǎn)酶發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，對于提高漆酶產(chǎn)量和酶活具有重要意義。漆酶的合成和分泌受到營養(yǎng)水平、培養(yǎng)條件、生長階段以及培養(yǎng)基中誘導(dǎo)劑的嚴(yán)格調(diào)控，木質(zhì)素或木質(zhì)素相關(guān)的芳香類化合物、N源和C源也能調(diào)節(jié)漆酶的合成[18]。

微生物酶類分為組成酶和誘導(dǎo)酶。組成酶是指微生物無論在任何培養(yǎng)基中，總是適量地存在的一些酶類；誘導(dǎo)酶是依賴于酶作用底物或底物結(jié)構(gòu)類似物的存在而合成的酶類[19]。漆酶胞外組成酶產(chǎn)量較低，當(dāng)添加與木質(zhì)素或木質(zhì)素衍生物相關(guān)的芳烴類和酚類誘導(dǎo)物時(shí)，能顯著提高漆酶酶活。Hao[20]研究發(fā)現(xiàn)，ABTS、甲苯胺和對苯二酚對新疆野生巴爾喀什蘑菇產(chǎn)漆酶有明顯的促進(jìn)作用，而咖啡酸、沒食子酸、鄰苯二酚、2，6-二甲氧基釀和愈創(chuàng)木酸對產(chǎn)酶誘導(dǎo)不明顯。Li等[21]利用Cu2+和麥麩作為共同誘導(dǎo)劑使白腐菌產(chǎn)漆酶活性達(dá)到51004 U/L。木蹄層孔菌(F.fomentarius)SO3漆酶對不同種類、不同濃度的金屬離子以及誘導(dǎo)劑的響應(yīng)不盡相同，表明其具有較復(fù)雜的生理功能及調(diào)控機(jī)制，結(jié)果可為進(jìn)一步闡明漆酶作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

培養(yǎng)基是發(fā)酵工藝優(yōu)化中的重要因素，本試驗(yàn)在基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，對碳氮源進(jìn)行了進(jìn)一步的篩選，并利用正交試驗(yàn)對篩選出的碳氮源進(jìn)行組合，最終確定0.5%酵母粉、2.5%麥麩、0.5%葡萄糖、0.5%磷酸二氫銨的最優(yōu)組合，此時(shí)漆酶活性可達(dá)10 863 U/L。Chen等[22]對產(chǎn)漆酶黃孢原毛平革菌的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選優(yōu)化，最終確定乳糖和酵母粉為最佳碳、氮源，使該菌的產(chǎn)酶能力提高了4.7倍。 Liu等[23]采用20 g/L 蔗糖、2 g/L酵母膏、3.2 g/L K2HPO4、0.2 g/L MgSO4·7H2O、3 mg/L SDS、6 mmol/L Cu2+、pH7.0的優(yōu)化培養(yǎng)基，使有柄樹舌靈芝菌產(chǎn)漆酶活性達(dá)到496.18 U/mL，是優(yōu)化前的12.2倍。

雙向電泳的主要分泌蛋白質(zhì)譜分析結(jié)果表明，木蹄層孔菌(F.fomentarius)SO3漆酶胞外分泌蛋白類型主要為LaccaseE(Trametessp.420)，獲得了該蛋白質(zhì)的10個(gè)漆酶氨基酸序列片段，為后續(xù)差異基因表達(dá)序列的獲得提供了依據(jù)。