王 瑩，陶鳳瑛，崔東紅，劉玉敏，吳亞妮

1上海交通大學(xué)設(shè)計(jì)學(xué)院；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心；3上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心,上海 200240

精神疾病是世界公共衛(wèi)生領(lǐng)域的一項(xiàng)重大難題，據(jù)估計(jì)2020年抑郁癥可能發(fā)展成為世界第二大危害人體健康的疾病[1]。作為一種情感性障礙的臨床類型精神疾病，抑郁癥具體表現(xiàn)為睡眠困難、興趣喪失、食欲降低、情緒不穩(wěn)定等[2,3]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥與神經(jīng)遞質(zhì)的改變[4]，下丘腦-垂體-腎上腺軸[5]以及谷氨酰胺神經(jīng)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的紊亂[6]相關(guān)。西藥治療作為臨床治療抑郁癥的常用方式，存在有一定毒副作用和藥物依賴性的問(wèn)題。芳香嗅吸療法因操作方便、對(duì)紓解不良情緒具有良好的作用而在生活中被廣泛使用，有望逐步成為對(duì)傳統(tǒng)醫(yī)療手段的有益補(bǔ)充。

目前關(guān)于抑郁癥的干預(yù)研究主要集中在中、西醫(yī)藥物的應(yīng)用，少有關(guān)于抗抑郁復(fù)方精油香氣應(yīng)用于臨床的作用分析。本文基于氣相色譜高通量飛行質(zhì)譜(GC-TOF/MS)技術(shù)，分析抑郁癥患者聞香前后尿液中差異代謝物的變化，初步探討復(fù)方精油香氣抗抑郁的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑

抗抑郁復(fù)方精油，由上海交通大學(xué)設(shè)計(jì)學(xué)院芳香療法研究室提供，批號(hào)為20150316，主要由薰衣草、苦橙花、大西洋雪松、佛手柑、依蘭依蘭、檀香木、玫瑰等復(fù)配而成。尿素酶，生工生物工程；BSFTA(硅烷化試劑)、2-氯苯丙氨酸、甲醇/氯仿(3∶1)、甲氧胺吡啶溶液均使用上海交通大學(xué)分析測(cè)試中心試劑。

1.2 基于GC-MS技術(shù)測(cè)定抗抑郁復(fù)方精油精油成分

1.2.1 GC-MS儀器條件

7890B-5977B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀；色譜柱HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)；溫程序：初始柱溫50 ℃，加熱1 min后以3 ℃/min加熱至110 ℃，再以5 ℃/min加熱至220 ℃，保持5 min；載氣為高純度氦氣。質(zhì)譜儀條件：電離方式設(shè)為E1，電離電壓：70 eV；離子源溫度200 ℃；采用全掃描方式掃瞄，掃描范圍設(shè)為10～600m/z。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

結(jié)合GC/MS標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行成分的定性分析，按照標(biāo)準(zhǔn)譜圖與色譜峰的質(zhì)譜碎片圖對(duì)照，人工檢索確定每一種成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)；定量分析是根據(jù)檢測(cè)到的色譜峰峰面積歸一化法，計(jì)算各成分間的相對(duì)含量。

1.3 人體尿液樣本代謝物研究

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

志愿者尿液樣本均來(lái)自于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬精神衛(wèi)生中心。其中抑郁癥患者44人，根據(jù)DSM-IV(美國(guó)精神障礙的診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè))確診，抑郁癥狀至少一個(gè)月。所有患者自愿接受實(shí)驗(yàn)并簽署知情同意書(shū)，均無(wú)香氣或香料物質(zhì)過(guò)敏史及心肝腎等疾病。健康組為同期醫(yī)院體檢的健康人群，體檢身體健康，無(wú)臨床癥狀表現(xiàn)。具體情況如表1所示，3組性別、年齡、體重差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 志愿者生理指標(biāo)詳表

注：P>0.05，證明差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Note:P:analysis of variance shows thatP>0.05,which proves that the difference is not statistically significant.

1.3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

抑郁患者聞香組每天在下午2時(shí)集中在治療室內(nèi)嗅聞香氣45 min；抑郁患者不聞香組及健康組分別在下午2時(shí)集中在治療室休息45 min。分別在第0天、第10天、第20天對(duì)3組研究對(duì)象進(jìn)行尿液的采集與處理。

1.3.3 GC-TOF/MS質(zhì)譜檢測(cè)程序

Agilent 6890N色譜儀；色譜柱：DB-5MS毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；升溫程序：80 ℃加熱兩分鐘，以10 ℃/min加熱至180 ℃，再以5 ℃/min加熱至240 ℃，最后以25 ℃/min加熱至290 ℃，加熱9 min;載氣流速(恒流)1 mL/min；載氣：氮?dú)?。質(zhì)譜儀的電離方式設(shè)為E1，電離電壓：70 eV；進(jìn)樣口溫度270 ℃；接口溫度260 ℃；離子源溫度200 ℃；采用全掃描方式掃瞄，掃描范圍設(shè)為30～600m/z，20張/s TOF質(zhì)譜圖采集。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理及分析

將獲得的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Marker Lynx軟件包，生成含有保留時(shí)間、質(zhì)荷比、峰面積的三維矩陣。將處理后生成的文件導(dǎo)入 SIMCA-P 14.1 軟件中進(jìn)行分析，選擇VIP>1的物質(zhì)作為主要潛在代謝標(biāo)志物。根據(jù)所對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間和質(zhì)荷比(m/z)，初步確認(rèn)潛在標(biāo)志物的結(jié)構(gòu)并確定物質(zhì)。最后通MetaboAnalyst 4.0生物學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝通路的分析。

圖1 抗抑郁復(fù)方精油GC/MS總離子流圖Fig.1 TIC of compound essential oil derived by GC/MS

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方精油成分結(jié)果分析

抗抑郁復(fù)方精油的總離子電流圖見(jiàn)圖1，精油的分析結(jié)果見(jiàn)表2，共鑒定出41種化學(xué)物質(zhì)，占揮發(fā)油總含量的98.638%。其中含量最高的是右旋檸檬烯(7.35%)，其次是香茅醇(9.37%)、乙酸芳樟酯(6.92%)、芳樟醇(6.71%)等。

表2 抗抑郁復(fù)方精油主要成分和相對(duì)含量

續(xù)表2(Continued Tab.2)

序號(hào)No.化學(xué)成分Chemical composition保留時(shí)間tR(min)相對(duì)含量Relative content (%)39肉豆蔻酸異丙酯 Isopropyl myristate28.643 81.8940脫氫樅酸甲酯 Methyl dehydroabietate33.779 61.1741松香酸甲酯 Methyl abietate34.226 40.26

2.2 尿液GC-TOF/MS圖譜分析

圖2為志愿者尿液的TIC圖，從圖中可以看出在聞香前后一些譜峰出現(xiàn)了較為明顯的差異，圖譜包含了大量參與氨基酸代謝與牛磺酸代謝的各類代謝物的信息。

圖2 志愿者尿液GC-TOF/MS總離子流圖Fig.2 TIC of urine samples from volunteer derived by GC-TOF/MS

2.3 模式識(shí)別與判別分析

2.3.1 主成分分析得分圖

對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合分析，PCA(主成分分析)如圖3-圖4所示。圖3為正常組和抑郁患者不聞香組的對(duì)比結(jié)果，由于個(gè)體差異等原因，出現(xiàn)了離群樣本點(diǎn)，模型累積解釋率R2X=0.658，Q2=0.434，因此當(dāng)前 PCA模型能夠解釋兩組樣本之間的代謝差異。圖4為正常組和抑郁患者聞香組的對(duì)比結(jié)果。模型累積解釋率R2X =0.728，Q2=0.435，建立的PCA模型較為可靠。

2.3.2 OPLS-DA(正交偏最小二乘判別) 模式識(shí)別

圖5為正常組與抑郁患者不聞香組的OPLS-DA圖，說(shuō)明在不聞香的情況下，抑郁患者的情況沒(méi)有得到改善。R2X= 0.590，R2Y= 0.190，Q2=0.684，建立的數(shù)學(xué)模型可靠。

圖3 正常組與抑郁患者不聞香0天、10天、20天的PCA得分圖Fig.3 PCA scores plot of normal group and depression group without aroma for 0,10 and 20 days

圖4 正常組與抑郁患者聞香0天、10天、20天的PCA得分圖Fig.4 PCA scores plot of normal group and depression group with aroma for 0,10 and 20 days

圖5 正常組與抑郁患者不聞香0天、10天、20天的OPLS-DA得分圖Fig.5 OPLS-DA scores plot of normal group and depression group without aroma for 0,10 and 20 days

正常組與抑郁聞香組的OPLS-DA得分如圖6。抑郁癥患者組聞香干預(yù)后有傾向于正常組的趨勢(shì)，說(shuō)明抗抑郁復(fù)方精油對(duì)患者的代謝物調(diào)節(jié)有一定的作用。R2X= 0.622，R2Y= 0.688，Q2=0.60，模型的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)率較高。

圖6 正常組與抑郁患者聞香0天、10天、20天的OPLS-DA得分圖Fig.6 OPLS-DA scores plot of normal group and depression group with aroma for 0,10 and 20 days

為進(jìn)一步了解精油香氣干預(yù)前后志愿者代謝物的差異變化及復(fù)方精油的作用機(jī)制，采用OPLS-DA對(duì)抑郁患者聞香0天(T0)與正常組(N)、抑郁患者聞香10天(T1)、20天(T2)進(jìn)行分析，并得到對(duì)應(yīng)的S-Plot載荷圖，如圖7～圖12所示。結(jié)果表明T0與N、T1、T2均分離比較明顯，選取VIP>1的物質(zhì)進(jìn)行t檢驗(yàn)(P<0.05)，確定生物標(biāo)記物。

圖7 T0與N 的OPLS-DA得分圖Fig.7 OPLS-DA scores plot of T0 and N

圖8 T0與N的S-plot圖Fig.8 S-plot of T0 and N

圖9 T0與T1的OPLS-DA得分圖Fig.9 OPLS-DA scores plot of T0 and T1

圖10 T0與T1的S-plot圖Fig.10 S-plot of T0 and T1

圖11 T0與T2 的OPLS-DA得分圖Fig.11 OPLS-DA scores plot of T0 and T2

圖12 T0與T2 的S-plot圖Fig.12 S-plot of T0 and T2

2.4 生物標(biāo)記物鑒定

結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索對(duì)T0與N、T1、T2的差異代謝物進(jìn)行鑒定并分析含量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在尿液樣本中，T0與N比較共篩選到6種化合物，T0與T1、T2對(duì)比均篩選到4種化合物。代謝物主要為氨基酸類，鑒定出的代謝標(biāo)志物如表3～表5所示，其中聞香前后，有5個(gè)差異代謝物呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，1個(gè)下調(diào)。

表3 T0與N 代謝標(biāo)志物鑒定

注：VIP>1.0；OPLS-DA 多維分析得到的代謝物重要性參數(shù)；Change Trend 表示N與T0代謝物的變化趨勢(shì)?！硎綨中代謝物質(zhì)含量相對(duì)T0時(shí)增加，↓表示N中代謝物質(zhì)含量相對(duì)T0時(shí)減少。

Note:VIP>1.0;Metabolite importance parameters obtained from OPLS-DA multidimensional analysis;Change Trend indicates the change trend of N and T0metabolites.↑ indicates that the content of metabolic substances in N increases relative to T0,and ↓ indicates that the content of metabolic substances in N decreases relative to T0.

表4 T0與T1 代謝標(biāo)志物鑒定

注：VIP>1.0；OPLS-DA 多維分析得到的代謝物重要性參數(shù)；Change Trend 表示T1與T0代謝物的變化趨勢(shì)?！硎綯1中代謝物質(zhì)含量相對(duì)T0時(shí)增加，↓表示T1中代謝物質(zhì)含量相對(duì)T0時(shí)減少。

Note:VIP>1.0;Metabolite importance parameters obtained from OPLS-DA multidimensional analysis;Change Trend indicates the change trend of T1and T0metabolites.↑indicates that the content of metabolic substances in T1increases relative to T0,and ↓ indicates that the content of metabolic substances in T1decreases relative to T0.

表5 T0與T2 代謝標(biāo)志物鑒定

注：VIP>1.0；OPLS-DA 多維分析得到的代謝物重要性參數(shù)；Change Trend 表示T2與T0代謝物的變化趨勢(shì)。↑表示T2中代謝物質(zhì)含量相對(duì)T0時(shí)增加，↓表示T2中代謝物質(zhì)含量相對(duì)T0時(shí)減少。

Note:VIP>1.0;Metabolite importance parameters obtained from OPLS-DA multidimensional analysis;Change Trend indicates the change trend of T1and T0metabolites.↑indicates that the content of metabolic substances in T2increases relative to T0,and ↓ indicates that the content of metabolic substances in T2decreases relative to T0.

2.5 代謝通路篩選

將表4和表5鑒定出的標(biāo)記物，通過(guò)Metaboanalyst的通路分析模塊對(duì)代謝通路進(jìn)行鑒定，本文選擇P<0.05，Impact>0.1作為抗抑郁復(fù)方精油干預(yù)的主要代謝通路，包括甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝及?；撬岷蛠喤；撬岽x(圖13和14，表6和7)。

圖13 T0與T1代謝通路分析 Fig.13 Metabolic pathway analysis of T0 and T1注：A.牛磺酸和亞牛磺酸代謝；B.甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝。Note:A.Taurine and hypotaurine metabolism;B.Glycine,serine and threonine metabolism.

圖14 T0與T2代謝通路分析 Fig.14 Metabolic pathway analysis of T0 and T2注：A.甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝；B.牛磺酸代謝。Note:A.Glycine,serine and threonine metabolism;B.Taurine and hypotaurine metabolism.

3 結(jié)論

芳香植物精油的香氣成分對(duì)情緒調(diào)節(jié)有良好的效果。Lima等[7]的研究表明D-檸檬烯在鼻腔與腦的傳遞途徑效率較高且在舒緩精神壓力方面有較好效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)乙酸芳樟酯和芳樟醇在緩解精神抑郁癥狀方面具有顯著作用[8]。本文通過(guò)對(duì)尿液樣本深入分析發(fā)現(xiàn)抗抑郁復(fù)方精油的調(diào)節(jié)代謝途徑主要涉及以下兩個(gè)方面，說(shuō)明植物精油香氣對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)功能的正常發(fā)揮有一定的調(diào)節(jié)作用。

表6 T0與T1代謝通路分析結(jié)果

表7 T0與T2代謝通路分析結(jié)果

3.1 氨基酸代謝調(diào)節(jié)

氨基酸與生物生命活動(dòng)緊密相關(guān)。甘氨酸是人體內(nèi)非必要氨基酸，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[9]，對(duì)控制神經(jīng)元興奮方面有重要作用，當(dāng)其含量過(guò)多會(huì)增強(qiáng)NMDA受體的激動(dòng)生理效應(yīng)，而NMDA受體的過(guò)度激活被認(rèn)為是抑郁癥發(fā)病的原因之一[10,11]；絲氨酸是膳食蛋白的組成部分，是一種重要的氨基酸，可用作磷脂中堿的前體，絲氨酸本身和絲氨酸轉(zhuǎn)化為甘氨酸調(diào)節(jié)NMDA受體均可以影響中樞系統(tǒng)。

3.2 牛磺酸代謝調(diào)節(jié)

?；撬岽嬖谟谌梭w的大腦、心臟和腎臟中，具有很多生物學(xué)調(diào)節(jié)功能，如作為神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞膜的穩(wěn)定劑和促進(jìn)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)等[12,13]。缺少牛磺酸最顯著的癥狀是精神抑郁，有精神恍惚、睡眠障礙等表現(xiàn)。牛磺酸的含量影響了(-氨基丁酸受體及甘氨酸受體，臨床發(fā)現(xiàn)在幾乎所有抑郁癥患者都存在牛磺酸含量不足的現(xiàn)象[14,15]。