劉亞文，靳盼盼，許曉曦*，劉 芳*，孫芝蘭

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.青海湖肉業(yè)有限責(zé)任公司，青海 海南州 813000）

陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）屬革蘭氏陰性菌，廣泛存在于人和動(dòng)物的糞便及腸道，此外在水、泥土和植物中也均可檢出。雖然是腸道正常的菌種之一，但是作為條件致病菌，陰溝腸桿菌已經(jīng)成為引發(fā)感染的主要致病菌。有資料表明該菌對(duì)雞、豬等動(dòng)物具有致病作用，引起以腹瀉為主要癥狀的感染[1]。另外，在雞肉胴體表面、龍蝦制品、包裝食品的表面、米粉等中也發(fā)現(xiàn)了陰溝腸桿菌[2-4]。目前研究發(fā)現(xiàn)，陰溝腸桿菌引起的細(xì)菌性疾病越來(lái)越難以根治的部分原因與生物膜的形成有關(guān)，因?yàn)楸簧锬けＷo(hù)的細(xì)菌對(duì)殺菌劑（抗生素等）、宿主自身的免疫機(jī)制甚至是惡劣的環(huán)境都有很強(qiáng)的抵抗性。因此，生物膜內(nèi)細(xì)菌所獨(dú)有的生物學(xué)特點(diǎn)，使得抗生素治療對(duì)其效果較差[5]。尤其是一些致病菌較易附著定植生成生物膜，使得滅菌過(guò)程非常緩慢[6]。更有研究表明，生物膜的形成使病變細(xì)胞的耐藥性提高約10～1 000 倍[7]，即使沒(méi)有耐藥基因的微生物，一旦生成生物膜，抗菌藥物的治病性也會(huì)有很大程度的降低，但是當(dāng)生物膜被人為破壞后，抗菌藥物又可有效地作用于特定的微生物。

近年來(lái)，有機(jī)酸作為一種天然的有機(jī)化合物對(duì)食源性病原體的污染有顯著作用，比如一定濃度的乳酸能有效清洗牛肉表面的致病菌[8]，盡管有機(jī)酸被批準(zhǔn)用于食物防腐劑，但其在實(shí)踐中并沒(méi)有被廣泛接受。有研究表明，從植物中提取的莽草酸可破壞金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜進(jìn)而顯示出對(duì)其有效的抗菌活性[9]。銀杏酸C15:1和C17:1能夠顯著抑制聚苯乙烯和玻璃表面上的大腸桿菌生物膜形成[10]。植物中所含精油和其有機(jī)提取物可以明顯抑制細(xì)菌生物膜的形成[11-13]。此外，一些成分通過(guò)影響生物膜形成過(guò)程中的細(xì)菌黏附、胞外聚合物等成分和群體感應(yīng)系統(tǒng)的生成[14-15]來(lái)抑制生物膜的生成。大蒜提取物、茶多酚、香芹酚等物質(zhì)也不斷被用于抑制生物膜的實(shí)驗(yàn)中，并取得預(yù)期效果。從國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道來(lái)看，有關(guān)有機(jī)酸抑菌效果的研究較多，研究表明，低質(zhì)量濃度的乳酸對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng)基本沒(méi)有抑制；而當(dāng)乳酸質(zhì)量濃度超過(guò)0.9 mg/mL時(shí)則對(duì)這3 種菌有一定的抑制作用，其最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）分別為0.9、1.8、3.6 mg/mL[16]。相對(duì)而言，有關(guān)有機(jī)酸對(duì)細(xì)菌生物膜抑菌效果的研究較少。本實(shí)驗(yàn)以陰溝腸桿菌為目標(biāo)菌株，研究乳酸對(duì)該菌生物膜的抑制效果，為冷鮮肉的抑菌防腐技術(shù)提供新思路和理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與材料

陰溝腸桿菌（E. cloacae CY4）為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜禽加工研究室從新鮮羊肉中分離并保存。

胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth，TSB）北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司；苯乳酸 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乳酸 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；檸檬酸西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PE（Ultra View VOX）轉(zhuǎn)盤式激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM） 美國(guó)珀金埃爾默股份有限公司；EVO-LS10掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 德國(guó)卡爾蔡司股份公司；Bio Photo meter plus核酸蛋白測(cè)定儀 德國(guó)艾本德股份公司；酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek Instruments有限公司；Czone系列抑菌圈測(cè)量及菌落計(jì)數(shù)儀 杭州迅數(shù)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離及培養(yǎng)

將分離得到的陰溝腸桿菌CY4接種于新鮮無(wú)菌的TSB中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，在TSB瓊脂平板培養(yǎng)基上劃線并過(guò)夜培養(yǎng)，挑取典型的單菌落接種至新鮮的TSB液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。將菌液與體積分?jǐn)?shù)50%的無(wú)菌甘油以1∶1的體積比混合均勻，置于－40 ℃冷凍保存?；罨瘯r(shí)只需將凍存的菌液解凍，然后按1%接種量接種于無(wú)菌TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h待用。

1.3.2 乳酸對(duì)陰溝腸桿菌CY4的MIC的測(cè)定

按照二倍稀釋法測(cè)定乳酸對(duì)陰溝腸桿菌CY4的MIC，將過(guò)夜活化好的陰溝腸桿菌CY4菌液按1%接種量接種到10 mL TSB液體培養(yǎng)基內(nèi)并加入適量乳酸（根據(jù)乳酸的質(zhì)量濃度計(jì)算出接種到一定體積培養(yǎng)基所需的乳酸體積），使得乳酸的最終質(zhì)量濃度分別為10、5、2.50、1.25、0.625、0（對(duì)照組）mg/mL，37 ℃培養(yǎng)24 h。取每個(gè)梯度的菌液在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度值，以能抑制陰溝腸桿菌CY4生長(zhǎng)的最低乳酸質(zhì)量濃度為MIC。

1.3.3 乳酸對(duì)陰溝腸桿菌CY4生長(zhǎng)的影響

將過(guò)夜活化好的陰溝腸桿菌CY4菌液按1%接種量接種到5 mL TSB液體培養(yǎng)基內(nèi)并加入適量乳酸，使得菌液中乳酸終質(zhì)量濃度依次為5、2.50、1.25、0.625 mg/mL。在37 ℃、200 r/min下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別取2、4、5、6、12、24 h樣品菌液200 μL，測(cè)定其在600 nm波長(zhǎng)處的光密度值并繪制菌體在不同條件下的生長(zhǎng)曲線，分析不同質(zhì)量濃度乳酸對(duì)CY4菌株生長(zhǎng)的影響。

1.3.4 乳酸對(duì)陰溝腸桿菌CY4泳動(dòng)能力的影響

采用軟瓊脂平板法[17-19]測(cè)定陰溝腸桿菌CY4的泳動(dòng)能力。Swimming固體培養(yǎng)基含有1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，后同）胰蛋白胨、0.5%氯化鈉、0.25%葡萄糖和0.3%瓊脂。Swarming固體培養(yǎng)基含有2.50% LB培養(yǎng)基、0.05%葡萄糖和0.5%瓊脂。在以上培養(yǎng)基中分別加入適量乳酸（終質(zhì)量濃度分別為1/2、1/4、1/8 MIC）。將CY4菌置于TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心并去除上清液，用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4）重懸菌體，調(diào)節(jié)菌懸液的OD600nm至0.8～1.0之間。在每個(gè)固體培養(yǎng)基表面中心滴加3 μL菌懸液，分別在37 ℃下靜置培養(yǎng)8、20 h，利用Czone系列抑菌圈測(cè)量及菌落計(jì)數(shù)儀拍照并測(cè)定擴(kuò)散菌圈的直徑。

1.3.5 乳酸對(duì)陰溝腸桿菌CY4生物膜形成的影響

1.3.5.1 陰溝腸桿菌成膜能力的測(cè)定

按1.3.3節(jié)方法制備含不同質(zhì)量濃度乳酸的CY4菌液（乳酸的質(zhì)量濃度分別為1/2、1/4、1/8 MIC），混勻加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別在12、24、48、72 h取樣處理。吸除上層培養(yǎng)基并用PBS洗滌，晾干加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的結(jié)晶紫染液靜置染色30 min。吸除染液之后再次使用無(wú)菌PBS洗滌3 次，用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液脫色30 min，570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光密度值。

1.3.5.2 生物膜胞外多糖質(zhì)量濃度的測(cè)定

按1.3.3節(jié)方法制備含不同質(zhì)量濃度乳酸的各梯度菌液（乳酸質(zhì)量濃度分別為1/2、1/4、1/8 MIC），混勻加入24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別在12、24、48、72 h取樣處理。吸除上層培養(yǎng)基，無(wú)菌PBS洗滌3 次，然后加入1 mL的無(wú)菌PBS，連同孔壁和孔底黏附的菌體一起轉(zhuǎn)移于10 mL離心管中，6 000 r/min離心30 min，取上清液[20]。使用苯酚-硫酸法[21]測(cè)生物膜的胞外多糖質(zhì)量濃度，取上清液1 mL，加入0.5 mL體積分?jǐn)?shù)9%的苯酚溶液，加5 mL濃硫酸，100 ℃水浴15 min，冷卻至室溫測(cè)吸光度，對(duì)比生長(zhǎng)曲線得多糖質(zhì)量濃度。

1.3.6 乳酸對(duì)陰溝腸桿菌CY4生物膜微觀形態(tài)的影響

1.3.6.1 CLSM觀察

按1.3.3節(jié)方法制備含不同質(zhì)量濃度乳酸的各梯度菌液（乳酸的質(zhì)量濃度分別為1/2、1/4 MIC），混勻加入到Nunc? Lab-Tek? 8 孔腔室載玻片中，培養(yǎng)48 h后取樣處理。吸除上層培養(yǎng)基并用無(wú)菌PBS洗滌，晾干后加入染液避光染色30 min。使用LIVE/DEAD Bac Light?試劑盒對(duì)CY4生成的生物膜進(jìn)行染色，染液現(xiàn)配現(xiàn)用并避光保存。吸除染液后洗凈并室溫晾干，加入體積分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛溶液固定30 min，然后晾干移除上層隔板，并滴加BacLight? Mounting Oil，－20 ℃避光保存，用于CLSM觀察[22]。顯微鏡觀察選取60 倍油鏡。

1.3.6.2 SEM觀察

按1.3.3方法制備含不同質(zhì)量濃度乳酸的各梯度菌液（乳酸的質(zhì)量濃度分別為1/2、1/4 MIC），混勻加入到Nunc? Lab-Tek? 8 孔腔室載玻片中，48 h取樣處理。吸除培養(yǎng)基用無(wú)菌PBS洗滌并室溫晾干，加入體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液固定后晾干。移除隔板后用體積分?jǐn)?shù)1%的鋨酸溶液固定90 min。接下來(lái)用乙醇梯度脫水[23]，再使用體積分?jǐn)?shù)100%叔丁醇洗滌。將處理完成的載玻片進(jìn)行噴金處理用于SEM觀察，拍照時(shí)選取放大倍數(shù)為2 000 倍和5 000 倍[24]。

1.3.7 乳酸對(duì)陰溝腸桿菌CY4生物膜菌體內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)量的影響

按1.3.3節(jié)方法制備含不同質(zhì)量濃度乳酸的各梯度菌液（乳酸的質(zhì)量濃度分別為1/2、1/4 MIC），37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)12～24 h，離心吸除上層培養(yǎng)基，加入1 mL無(wú)菌PBS，再次離心收集菌泥。按照RNA prep Pure培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒的步驟說(shuō)明提取菌體的總RNA，接下來(lái)立即去除DNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。表1為實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）實(shí)驗(yàn)的引物，反應(yīng)體系共20 μL，其中SYBR Premix ExTaqⅡ 10 μL、引物2 μL、cDNA 3 μL、RNase Free dH2O 5 μL。目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)采用2－ΔΔCt法評(píng)估，ΔΔCt＝Ct處理組（Ct目標(biāo)基因－Ct管家基因）－Ct對(duì)照組（Ct目標(biāo)基因－Ct管家基因），以log2（2－ΔΔCt）＞1或log2（2－ΔΔCt）＜－1作為基因高表達(dá)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)指標(biāo)重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，兩個(gè)平行。測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel軟件、SPSS 17.0軟件和Statistix 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和制圖。顯著性水平設(shè)置為P＜0.05（采用Tukey HSD顯著性分析方法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸對(duì)陰溝腸桿菌CY4生長(zhǎng)的影響

圖1 不同乳酸質(zhì)量濃度下陰溝腸桿菌CY4生長(zhǎng)曲線Fig. 1 Growth curves of Enterobacter cloacae CY4 in the presence of different lactic acid concentrations

根據(jù)對(duì)陰溝腸桿菌CY4菌液渾濁度及OD600nm的檢測(cè)，可確定乳酸對(duì)陰溝腸桿菌CY4的MIC為5 mg/mL。由圖1可知，在乳酸質(zhì)量濃度達(dá)到5 mg/mL時(shí)，陰溝腸桿菌CY4的生長(zhǎng)完全被抑制；當(dāng)乳酸質(zhì)量濃度為2.50 mg/mL時(shí)，CY4的生長(zhǎng)較對(duì)照組有輕微的抑制；而當(dāng)乳酸質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL和0.625 mg/mL時(shí)，可以看出其對(duì)CY4的處理結(jié)果和對(duì)照組相比無(wú)明顯的抑制現(xiàn)象，基本和對(duì)照組的生長(zhǎng)曲線重合。即在質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL和0.625 mg/mL時(shí)，經(jīng)乳酸處理的菌株CY4的最大生長(zhǎng)量與對(duì)照組基本一致，因此接下來(lái)研究幾個(gè)亞抑菌濃度（2.50、1.25、0.625 mg/mL）的乳酸對(duì)菌株CY4生物膜的抑制作用。有研究表明，當(dāng)沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度大于8 mg/mL時(shí)會(huì)影響大腸桿菌和變形鏈球菌的生長(zhǎng)，而低質(zhì)量濃度的沒(méi)食子酸對(duì)生物膜的抑制作用可能與除抗菌作用外的其他因素有關(guān)[25]。0.5 mg/mL的莽草酸只對(duì)金黃色葡萄球菌的生物膜有作用而對(duì)菌體的浮游生長(zhǎng)沒(méi)有顯著干擾[18]。

2.2 乳酸對(duì)陰溝腸桿菌CY4泳動(dòng)能力的影響

由圖2A可知，經(jīng)乳酸處理菌株的泳動(dòng)范圍相對(duì)于對(duì)照組而言明顯縮小，在Swimming平板中，隨著質(zhì)量濃度的增大，菌圈一直在縮小（圖2A2～A4），甚至在質(zhì)量濃度為2.50 mg/mL時(shí)，菌圈不僅是處理組中直徑最小的，顏色也非常淡；而在Swarming平板中，經(jīng)過(guò)20 h的培養(yǎng)，對(duì)照組菌株的泳動(dòng)范圍明顯較其他處理組的大，而隨著處理質(zhì)量濃度的增大，其菌圈直徑也在不斷縮?。▓D2A5～A8）。由圖2B可知，乳酸的處理對(duì)陰溝腸桿菌CY4泳動(dòng)能力（Swarming和Swimming）有明顯的抑制作用，且隨著質(zhì)量濃度的升高，菌圈直徑越來(lái)越小，不同質(zhì)量濃度之間也存在顯著性差異（P＜0.05）。研究發(fā)現(xiàn)，菌體的運(yùn)動(dòng)性與細(xì)胞的初期黏附和生物膜形成有關(guān)，比如沒(méi)食子酸和阿魏酸抑制了金黃色葡萄球菌的菌株運(yùn)動(dòng)并影響其生物膜的形成，也就是說(shuō)有些有機(jī)酸可以通過(guò)降低菌體的運(yùn)動(dòng)性來(lái)減少生物膜的形成量[26]。在本實(shí)驗(yàn)中由于鞭毛的泳動(dòng)能力對(duì)菌株早期的黏附聚集形成生物膜有很大的影響，因此乳酸很有可能通過(guò)抑制陰溝腸桿菌的運(yùn)動(dòng)對(duì)菌株早期的黏附能力產(chǎn)生影響，并抑制菌落聚集形成生物膜。

圖2 乳酸對(duì)陰溝腸桿菌CY4泳動(dòng)能力的抑制作用Fig. 2 Lactic acid inhibited swimming and swarming motilities of Enterobacter cloacae CY4

2.3 乳酸對(duì)陰溝腸桿菌CY4生物膜形成的影響

2.3.1 陰溝腸桿菌的成膜能力

生物膜的胞外聚合物中含有大量糖分，結(jié)晶紫作為一種堿性染料，易與多糖物質(zhì)及核酸結(jié)合，因此根據(jù)結(jié)晶紫染色后的顏色深淺及光密度值的變化可以推測(cè)菌株成膜能力的強(qiáng)弱[27]。

圖3 乳酸對(duì)陰溝腸桿菌CY4生物膜成膜能力的影響Fig. 3 Effect of lactic acid on biofilm formation of Enterobacter cloacae CY4

由圖3A可知，以12 h的結(jié)晶紫染色孔板為例，不同質(zhì)量濃度乳酸處理的陰溝腸桿菌生物膜在顏色上有明顯不同，隨著乳酸質(zhì)量濃度的升高，染色程度越淺。如圖3B所示，通過(guò)對(duì)不同處理時(shí)間在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)得的光密度值可知，12 h時(shí)，各乳酸處理組均與對(duì)照組有顯著差異（P＜0.05），且不同質(zhì)量濃度乳酸處理組之間也都存在顯著性差異（P＜0.05）；而在長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)條件下，0.625 mg/mL乳酸處理組與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05），1.25、2.50 mg/mL的乳酸仍可顯著抑制菌株的成膜能力（P＜0.05）。

乳酸處理極大地影響了陰溝腸桿菌生物膜的成膜能力，其影響程度可能與生物膜的成熟程度有關(guān)?，F(xiàn)有研究表明，有機(jī)酸具有抗菌膜活性。如檸檬酸對(duì)從原料乳中分離出的金黃色葡萄球菌菌株形成的生物膜具有顯著抑制作用[28]，莽草酸對(duì)金黃色葡萄球菌形成的生物膜有顯著影響，沒(méi)食子酸和綠原酸對(duì)金黃色葡萄球菌的生物膜形成和代謝活性也有明顯的抑制作用[29]。

2.3.2 生物膜胞外多糖質(zhì)量濃度

胞外多糖是細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，與生物膜的合成及抗生素抗性的形成有著較強(qiáng)關(guān)聯(lián)[30]，因此，通過(guò)對(duì)細(xì)菌胞外多糖合成的抑制可達(dá)到阻礙生物膜的形成的目的。通過(guò)苯酚-硫酸法得到多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得多糖質(zhì)量濃度與吸光度的線性關(guān)系方程為y＝0.006 8x+0.000 7（r2＝0.99），用于計(jì)算多糖質(zhì)量濃度。

圖4 乳酸對(duì)陰溝腸桿菌CY4 生物膜胞外多糖合成的影響Fig. 4 Effect of lactic acid on extracellular polysaccharide production in Enterobacter cloacae CY4 biofilm

由圖4可知，乳酸處理相對(duì)于對(duì)照組有顯著性差異（P＜0.05），且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖質(zhì)量濃度也在不斷增加，對(duì)照組和較高乳酸質(zhì)量濃度處理組在48 h達(dá)到最高合成量，而較低乳酸質(zhì)量濃度處理組在72 h仍略有增長(zhǎng)。綜上，在72 h的培養(yǎng)過(guò)程中，乳酸處理可明顯抑制多糖的合成。

2.4 乳酸對(duì)陰溝腸桿菌CY4生物膜微觀形態(tài)的影響

2.4.1 CLSM觀察結(jié)果

圖5 乳酸對(duì)陰溝腸桿菌CY4生物膜成膜厚度的影響Fig. 5 Effect of lactic acid on the thickness of Enterobacter cloacae CY4 biofilm

CLSM可在一定程度上反映成膜厚度的變化[31]。由圖5可知，在48 h時(shí)，有機(jī)酸的處理明顯地對(duì)菌體生物膜厚度產(chǎn)生了影響。由圖5A可知，對(duì)照組培養(yǎng)的生物膜結(jié)構(gòu)厚重且緊密平整，整體呈現(xiàn)綠色，但仍可見(jiàn)部分受損細(xì)胞表現(xiàn)為紅色。通過(guò)對(duì)比2.50 mg/mL（圖5B）和1.25 mg/mL（圖5C）乳酸處理組可知，經(jīng)過(guò)乳酸處理的生物膜厚度明顯變薄，且隨著質(zhì)量濃度的升高，生物膜的厚度隨之變薄。這一結(jié)果表明，乳酸在很大程度上影響了生物膜胞外物質(zhì)的含量，也就是說(shuō)，有機(jī)酸處理可以使得菌株生長(zhǎng)所產(chǎn)生的具有保護(hù)機(jī)制的生物膜有效減少，有利于進(jìn)一步的滅菌保鮮操作。

2.4.2 SEM觀察結(jié)果

由圖6可知，在48 h時(shí)，乳酸處理明顯對(duì)菌體的外在聚集狀態(tài)產(chǎn)生了影響。對(duì)于對(duì)照組（圖6A）來(lái)說(shuō)，菌體形成了明顯的聚集形狀且表面較緊密，菌體呈現(xiàn)出大小一致的圓桿狀，菌體表面可明顯看到有很厚的附著物包裹。乳酸處理組SEM觀察結(jié)果如圖6B、C所示，菌體明顯呈現(xiàn)散亂無(wú)章的狀態(tài)，細(xì)胞層數(shù)較對(duì)照組變少，且不能形成規(guī)則緊密的聚集團(tuán)，表面空隙較多，乳酸的處理可能對(duì)細(xì)菌結(jié)構(gòu)產(chǎn)生致變作用，使得菌體之間長(zhǎng)短不一且表面凹凸不平，菌體之間連接不緊密，高質(zhì)量濃度的處理使樣品之間的空隙變得更大。

圖6 乳酸對(duì)陰溝腸桿菌CY4生物膜菌體聚集狀態(tài)的影響Fig. 6 Effect of lactic acid on cell aggregation in Enterobacter cloacae CY4 biofilm

由圖6可以明顯看出乳酸處理的陰溝腸桿菌生物膜形成的完整性情況，證實(shí)了乳酸具有抗菌膜活性。未經(jīng)處理的對(duì)照組生物膜表面有明顯的附著物包裹，并形成較厚的聚集體，相對(duì)而言，經(jīng)乳酸處理的生物膜出現(xiàn)明顯的單層和結(jié)構(gòu)松散現(xiàn)象，隨著乳酸質(zhì)量濃度的增大，菌體表面的附著物也在明顯地減少，菌體越來(lái)越清晰且相互之間的黏連減少（圖6B、C）。此外，部分菌株受損變形，長(zhǎng)短不一。這一現(xiàn)象和先前的研究相符合：目前市場(chǎng)上的很多抗生素制劑也能夠?qū)Y(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物膜有一定的破壞作用并有可能使菌落結(jié)構(gòu)松散[24]。

2.5 乳酸對(duì)陰溝腸桿菌CY4生物膜菌體內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)量的影響

由圖7可知，乳酸對(duì)陰溝腸桿菌CY4生物膜菌體內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)量有顯著影響。經(jīng)乳酸處理的生物膜菌體中的相關(guān)基因表達(dá)量明顯地較對(duì)照組菌體中的基因表達(dá)量低（log2（2－ΔΔCt）＜－1）。其中ebpB、ebpC是生物膜黏附相關(guān)基因，wza、wzb、wca是與胞外多糖合成相關(guān)基因。以log2（2－ΔΔCt）＞1或log2（2－ΔΔCt）＜－1作為基因高表達(dá)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，如圖7所示，2.50 mg/mL和1.25 mg/mL的乳酸處理均顯著下調(diào)了陰溝腸桿菌CY4內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)量。相關(guān)基因表達(dá)量的下調(diào)也進(jìn)一步說(shuō)明了乳酸的處理影響了多糖物質(zhì)的合成及分泌，致使細(xì)菌的黏附聚集和擴(kuò)散能力下降，因此抑制了生物膜的生成。

圖7 陰溝腸桿菌CY4生物膜內(nèi)菌體細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)量變化Fig. 7 Changes in relative expression levels of biofilm-related genes in Enterobacter cloacae CY4

3 結(jié) 論

近年來(lái)，由于人們對(duì)于食品安全問(wèn)題的關(guān)注，生物膜抑制的有關(guān)研究也越來(lái)越深入，抑制物的選擇越來(lái)越趨向于天然、安全、抑菌效果強(qiáng)的物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)選取乳酸對(duì)陰溝腸桿菌CY4形成的生物膜進(jìn)行研究。通過(guò)結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度下的乳酸處理對(duì)CY4生物膜的形成有明顯的抑制作用；CLSM和SEM觀察發(fā)現(xiàn)乳酸處理使細(xì)菌生物膜的厚度大幅降低、結(jié)構(gòu)松散、表面孔洞較多且不平滑，菌株表面附著物大幅減少；菌體泳動(dòng)能力實(shí)驗(yàn)和胞外多糖質(zhì)量濃度檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明乳酸處理影響了菌體黏附和多糖合成能力；實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了乳酸降低了菌體內(nèi)與黏附和多糖產(chǎn)生相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。本研究表明，亞抑菌濃度下的乳酸通過(guò)抑制多糖物質(zhì)的合成及分泌、降低菌體的黏附聚集能力來(lái)抑制陰溝腸桿菌CY4生物膜的形成。