彭 俊，勵(lì) 飛，劉 維

（湖南九鼎動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究院有限公司，長(zhǎng)沙 410007）

近年來(lái)，隨著養(yǎng)殖、飼料加工等行業(yè)的發(fā)展，飼料資源短缺的問(wèn)題日益加劇，而豆粕具有營(yíng)養(yǎng)全面、粗蛋白含量高、氨基酸組成均衡等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于飼料生產(chǎn)中。因此，如何去除豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子、提高小肽及其在畜禽中消化率、畜禽腸道健康等是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)課題。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，微生物發(fā)酵豆粕是一種多功能的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)原料，而絲狀真菌在發(fā)酵豆粕中的研究應(yīng)用也有部分的研究報(bào)道。絲狀真菌以其代謝產(chǎn)復(fù)雜酶系、少量有機(jī)酸、生物健康因子等優(yōu)勢(shì)在豆粕發(fā)酵處理中有巨大潛力。本文就絲狀真菌在發(fā)酵豆粕中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行概述，以期為絲狀真菌在發(fā)酵豆粕中研究應(yīng)用提供參考。

1 發(fā)酵豆粕研究現(xiàn)狀

1.1 豆粕原料特點(diǎn)

豆粕是大豆被榨油后的副產(chǎn)物，其營(yíng)養(yǎng)全面且豐富，粗蛋白質(zhì)含量高達(dá)50%，含有多種必需氨基酸，特別是其他植源性原料所缺乏的賴氨酸含量高達(dá)2.5%～3.0%[1]?；谀壳帮暳闲袠I(yè)中動(dòng)物蛋白魚粉、骨粉的價(jià)格高昂及其資源的有限性，豆粕成為了有效的替代品，也是目前飼料工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的植物性蛋白質(zhì)原料。但是把豆粕直接作為動(dòng)物飼料的原料，會(huì)由于豆粕中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)很大程度上得不到充分的利用和吸收，這直接浪費(fèi)了大量的營(yíng)養(yǎng)資源，降低了飼料的利用率，同時(shí)豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子也給動(dòng)物的生長(zhǎng)繁殖帶來(lái)了眾多不利的影響[2]。

1.2 豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子

飼料中一類影響其營(yíng)養(yǎng)成分的消化吸收以及可以使動(dòng)物產(chǎn)生不適反應(yīng)的物質(zhì)稱為抗?fàn)I養(yǎng)因子。目前在豆粕中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了10 多類抗?fàn)I養(yǎng)因子，根據(jù)對(duì)溫度的敏感程度可以分為熱敏性抗?fàn)I養(yǎng)因子（對(duì)溫度較為敏感，在高溫下容易變性）和熱穩(wěn)定性抗?fàn)I養(yǎng)因子（在高溫下保持穩(wěn)定存在）兩類。熱敏性抗?fàn)I養(yǎng)因子主要有胰蛋白酶抑制劑、脲酶和大豆凝集素等，熱穩(wěn)定性營(yíng)養(yǎng)因子主要包括大豆抗原蛋白、植酸和寡糖（水蘇糖和棉籽糖）等[3-4]。大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子特點(diǎn)及特性見附表[5-10]。

附表 大豆抗?fàn)I養(yǎng)因子類別及特點(diǎn)

1.3 豆粕處理方式及發(fā)酵豆粕特點(diǎn)

早期對(duì)豆粕的處理方式主要有兩種：通過(guò)物理高溫處理豆粕，酶水解豆粕。化學(xué)法處理豆粕藥劑殘留毒素對(duì)動(dòng)物健康影響太大，極少應(yīng)用。高溫加工豆粕缺點(diǎn)是豆粕中大量蛋白在高溫下變性、溶解度降低，同時(shí)使豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值大打折扣，豆粕中氨基酸結(jié)構(gòu)發(fā)生改變或者被破壞，這也使得動(dòng)物對(duì)蛋白的消化吸收率嚴(yán)重降低[11]。同樣酶解豆粕使得成本變得高昂、耗水量大、能耗高等缺點(diǎn)[12]。目前，微生物固態(tài)發(fā)酵豆粕是當(dāng)前處理豆粕的研究熱點(diǎn)，以豆粕為主要原料，利用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)接種單一或者復(fù)合微生物發(fā)酵菌劑，控制一定的發(fā)酵條件（水分、濕度、溫度等）處理豆粕。其優(yōu)勢(shì)是成本低、安全和環(huán)保，可降低抗?fàn)I養(yǎng)因子的抑制作用，提高蛋白質(zhì)的消化利用率，生物活性因子高，含有一定益生菌，有益動(dòng)物腸道健康[13-14]。

2 絲狀真菌在發(fā)酵豆粕中應(yīng)用現(xiàn)狀

2.1 絲狀真菌在發(fā)酵豆粕中應(yīng)用菌株及特點(diǎn)

絲狀真菌是指絲狀，無(wú)光合作用的異氧型真核微生物，菌絲球是絲狀真菌培養(yǎng)過(guò)程中形成的松散且不規(guī)則、致密或光滑的球形、近球形微生物顆粒，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)各不相同，菌絲球按形態(tài)可分為松散型、緊密型和空心菌絲球，目前菌絲球的形成機(jī)理已有大量研究[15-18]。絲狀真菌在工業(yè)發(fā)酵和科研方面應(yīng)用非常廣泛，常用作發(fā)酵菌株的有米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、白地霉（Geotrichum candidum）、白腐真菌、木霉（Trichoderma spp.）、土曲霉（Aspergillus terreus）、毛霉（mucor）、紅曲霉（Monascus purpureus Went）等[19]。絲狀真菌在很多食品、飼料原料的發(fā)酵處理中發(fā)揮著重要作用，能產(chǎn)生復(fù)雜的酶系如：糖化酶、蛋白酶、脂肪酶、糖化酶等酶系，對(duì)降解發(fā)酵原料和原料呈香呈味物質(zhì)具有重大貢獻(xiàn)[20-22]。目前豆粕發(fā)酵菌種一般采用芽孢桿菌和乳酸菌等較易控制的細(xì)菌等發(fā)酵，其中絲狀真菌在豆粕發(fā)酵中的研究較少，主要有黑曲霉、米曲霉、木霉、米根霉（Rhizopus oryzae Went et Pr.Geerl.）、產(chǎn)黃青霉（Penicillium Chrysogenum）等，其中被市場(chǎng)接受且在豆粕中發(fā)酵最廣泛的是黑曲霉和米曲霉兩種絲狀真菌[23]。

2.1.1 黑曲霉及其在發(fā)酵豆粕中的應(yīng)用

黑曲霉屬于真核生物子囊菌亞門，絲孢目，叢梗孢科，是一種常見的曲霉屬真菌，廣泛分布在谷物、空氣、土壤等環(huán)境中，黑曲霉是公認(rèn)安全的微生物[24]。且黑曲霉的萌發(fā)生長(zhǎng)速度較快，產(chǎn)酶周期較短，用黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)酶的種類豐富、安全性高且不會(huì)代謝產(chǎn)生毒素[25-27]。據(jù)統(tǒng)計(jì)調(diào)查，許多主要商品酶制劑都來(lái)源于黑曲霉，分別是α-淀粉酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素酶、α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、β-葡萄糖苷酶、半纖維素酶、橙皮苷酶、脂肪酶、果膠酶、柚苷酶、蛋白酶和單寧酶，在工業(yè)酶制劑生產(chǎn)中具有重要作用[28]。因此，黑曲霉在豆粕中應(yīng)用可以降解豆粕中非淀粉多糖、蛋白質(zhì)、細(xì)胞壁等，進(jìn)而提高豆粕消化吸收率，此外黑曲霉還能代謝產(chǎn)生多種有機(jī)酸、維生素和未知生長(zhǎng)因子從而提高豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。吳寶昌等利用黑曲霉和枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵豆粕，優(yōu)化發(fā)酵條件后可將豆粕中肽的轉(zhuǎn)化率提高至40.8%[29]。楊文宇等利用黑曲霉和枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵作為前發(fā)酵，再接種釀酒酵母和保加利亞乳桿菌作為后發(fā)酵，能將大豆肽轉(zhuǎn)化率提高至65.8%[30]。鄭環(huán)宇等篩選最優(yōu)豆粕菌種黑曲霉、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母接種比例為2∶1∶1∶2，進(jìn)行固態(tài)高溫發(fā)酵，結(jié)果表明豆粕中粗蛋白質(zhì)含量增加24.36%，且豆粕中氨基酸提高了約7%，胰蛋白酶抑制劑基本被清除，抗原蛋白大部分被降解[31]。朱平軍等以黑曲霉為菌種接種豆粕發(fā)酵，采用單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵72 h、溫度28 ℃、接種量為4%、料水比1∶0.9，黑曲霉發(fā)酵豆粕使酸溶蛋白酶含量由1.75%增加至13.62%，這是因?yàn)楹谇乖诎l(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等消化酶對(duì)助于豆粕分解消化，且黑曲霉分泌酸性蛋白酶主要是端肽酶，其功能是從大豆蛋白肽鏈的末端開始水解，特異性酶切使大分子蛋白質(zhì)被分解為小豆肽[32-33]。

2.1.2 米曲霉及其在發(fā)酵豆粕中應(yīng)用

米曲霉是半知菌亞口，絲抱綱，絲抱目，從梗抱科，同黑曲霉一樣是曲霉屬真菌中的一個(gè)常見種，分布甚廣，主要分布在糧食、腐敗有機(jī)物和土壤等環(huán)境中，是我國(guó)傳統(tǒng)釀造醬油、酒類及制作豆醬的重要菌種，具有良好的蛋白分泌能力，被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)定為食品安全菌株（GRAS）[34-35]。米曲霉在發(fā)酵中也同黑曲霉一樣能分泌復(fù)雜的酶系，分解糖類和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，其也應(yīng)用于多種重組酶和天然酶的工業(yè)化生產(chǎn)，如以淀粉物質(zhì)原料為基質(zhì)誘導(dǎo)分泌系列淀粉酶，利用馬鈴薯粉渣生產(chǎn)酸性蛋白酶，利用麩皮生產(chǎn)中性蛋白酶等，此外米曲霉還可分泌羧肽酶、木聚糖酶、植酸酶、脂肪酶類、纖維素酶、柚苷酶等。米曲霉和黑曲霉的生長(zhǎng)產(chǎn)酶溫度也存在差異，黑曲霉在28 ℃生長(zhǎng)產(chǎn)酶較佳，且以糖化酶和液化酶為主，米曲霉較佳的生長(zhǎng)產(chǎn)酶溫度較高為35 ℃，其產(chǎn)蛋白酶較高[36-39]。相比于黑曲霉，Cristiane等研究表明，米曲霉具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)合成及分泌能力以及強(qiáng)大的翻譯后修飾能力，且米曲霉基因序列中特異性序列上有大量的與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因，這也為后續(xù)較多研究者有針對(duì)性的在米曲霉基因中進(jìn)行改造以獲得其目的酶的高效表達(dá)[40]。孫立斌等利用通過(guò)紫外誘變和遺傳穩(wěn)定性篩選出能穩(wěn)定高產(chǎn)蛋白酶的米曲霉菌株，并應(yīng)用菌株優(yōu)化發(fā)酵工藝：初始pH 5.5、30 ℃、發(fā)酵48 h、接種量9%、搖床培養(yǎng)轉(zhuǎn)速160 r·min-1條件下水解豆粕程度達(dá)到24.05%[41]。于瀟淳分別從短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和黑曲霉中擴(kuò)增到堿性蛋白酶和酸性蛋白酶的基因，在通過(guò)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)入到米曲霉菌株中，并選育獲得高效表達(dá)酶活菌株發(fā)酵豆粕，工程菌堿性蛋白酶活力和酸性蛋白酶活力較野生菌株高140%和242%，其對(duì)豆粕原料水解率和多肽轉(zhuǎn)化率均較野生型菌株有所提高[42]?；菝鞯炔捎每莶菅挎邨U菌和米曲霉混合接種比例3∶1（v/v）、接種量2%、40 ℃培養(yǎng)、發(fā)酵60 h，發(fā)酵豆粕中游離氨基酸較發(fā)酵前有顯著提高[43]。黃永鋒優(yōu)化米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶最優(yōu)培養(yǎng)基及條件為：豆粕8.8%、麩皮35.2%、水55%、KH2PO41.0%、接種量為11%、在30 ℃培養(yǎng)108 h，在此條件下測(cè)得中性蛋白酶酶活力為5 863.5 U·g-1，應(yīng)用至豆粕中接種干米曲13%，30 ℃發(fā)酵24 h，酶活力4 523.5 U·g-1，水解度23.1%，還原糖含量6.5%[44]。史玉寧等采用米曲霉和釀酒酵母在水分45%、米曲霉、釀酒酵母接種量分別為0.5%、4%，添加酶制劑0.1%的條件下，發(fā)酵豆粕粗蛋白質(zhì)提高了21.27%、酸溶蛋白提高了695.97%[45]。黃明達(dá)等用響應(yīng)面發(fā)優(yōu)化米曲霉、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母組合發(fā)酵豆粕發(fā)酵條件：接種量10%（米曲霉、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母接種比例1∶1∶2）、發(fā)酵溫度32 ℃、含水量60%、發(fā)酵72 h發(fā)酵豆粕的酸溶蛋白含量提高至20.73%[46]。

2.2 絲狀真菌在發(fā)酵豆粕中應(yīng)用工藝

絲狀真菌的生長(zhǎng)繁殖在滿足營(yíng)養(yǎng)條件下主要影響的因素有生長(zhǎng)溫度、濕度、氧氣供應(yīng)程度等。低溫會(huì)抑制絲狀真菌的酶活性及新陳代謝等，適宜的溫度是菌株快速萌發(fā)生長(zhǎng)的必備條件。很多新陳代謝及生化反應(yīng)都是在有水的情況下進(jìn)行的，因而濕度對(duì)絲狀真菌的生長(zhǎng)繁殖也很關(guān)鍵，此外絲狀真菌的生長(zhǎng)繁殖是與氧氣不可分離的，沒有氧氣絲狀真菌很難生長(zhǎng)繁殖。在多菌種混合發(fā)酵中，還會(huì)與其他微生物產(chǎn)生頡頏作用或者協(xié)同作用，不同菌株有不同的表現(xiàn)需要視具體菌株而定。這些影響絲狀真菌生長(zhǎng)繁殖的因素也是其在發(fā)酵豆粕中應(yīng)用工藝控制的技術(shù)要點(diǎn)[47]。豆粕淺層發(fā)酵工藝一般物料厚度＜5 cm，適用于純好氧發(fā)酵或者前期好氧發(fā)酵，物料薄通氣較好有利于氧氣的充分?jǐn)U散，而深層發(fā)酵物料厚度一般＞30 cm，主要適合前期好氧、中后期兼性厭氧發(fā)酵[48]。黃永鋒采用前48 h用黑曲霉、枯草芽孢桿菌和酵母菌（接種比例4%、2%、2%，料水比1∶0.9）30 ℃好氧發(fā)酵，后48 h再接種植物乳桿菌（接種量2%，料水比1∶1.2）和瘤胃微生物37 ℃厭氧仿生發(fā)酵，此條件下發(fā)酵豆粕中胰蛋白酶抑制劑含量由發(fā)酵前的12.8 mg·g-1降低到0.1 mg·g-1，粗蛋白質(zhì)含量由發(fā)酵前的43.75%提高到52.03%，乳酸含量達(dá)到2.13%，酸溶蛋白可達(dá)20.06%，此外發(fā)酵完后豆粕中蛋白酶活力可達(dá)491 U·g-1。考書娟等使用絲狀真菌YW-7和乳酸菌混合，并采用淺盤培養(yǎng)工藝發(fā)酵豆粕，料水比1∶0.8、YW-7接種量2%、乳酸菌接種量1.5%、料層厚度控制在2～3 cm、30 ℃好氧發(fā)酵24 h后轉(zhuǎn)為厭氧發(fā)酵48 h，發(fā)酵豆粕粗蛋白質(zhì)＞53%，肽含量23%，總酸2.5%，豆粕中水蘇糖、棉子糖降解去除效果顯著[22]。劉建峰用枯草芽孢桿菌F-11-06進(jìn)行前發(fā)酵（33 ℃、69 h），然后用黑曲霉F-11-08 和酵母菌F-11-12 進(jìn)行后發(fā)酵（25 ℃、28 h），可將豆粕蛋白質(zhì)的水解度提高到22.3%，其水解度較F-11-06 發(fā)酵的高6.8 倍較F-11-08和酵母菌F-11-12發(fā)酵的高330%[49]。

3 討論與小結(jié)

絲狀真菌在豆粕發(fā)酵中應(yīng)用的菌株種類較少，據(jù)最新飼料添加劑目錄中微生物種類顯示，目前僅黑曲霉和米曲霉作為安全菌株可以添加到飼料中應(yīng)用，這也是絲狀真菌在發(fā)酵豆粕中應(yīng)用較少的客觀原因。絲狀真菌在發(fā)酵豆粕中應(yīng)用研究目前主要集中在輔助豆粕分解上，其在豆粕中代謝酶系、酸類物質(zhì)等未進(jìn)行深入和全面的研究，且絲狀真菌在發(fā)酵豆粕中應(yīng)用仍有巨大的潛力，需要深入研究和開發(fā)。黑曲霉可代謝產(chǎn)生葡萄糖氧化酶、單寧酶等，葡萄糖氧化酶可在雞腸道內(nèi)能催化葡萄糖產(chǎn)生葡萄糖酸和過(guò)氧化氫，可抑制大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌，保護(hù)腸道健康并改善腸道消化環(huán)境等[50]。單寧有止瀉、抗炎等作用，可以結(jié)合蛋白質(zhì)和金屬離子等營(yíng)養(yǎng)素并能破壞微生物細(xì)胞膜的完整性[51-52]。微生物合成單寧酶可用于抵抗單寧對(duì)其的毒害作用，因此黑曲霉分解單寧也可應(yīng)用于止瀉抗炎的功能性發(fā)酵料的開發(fā)上。此外，絲狀真菌在發(fā)酵豆粕中應(yīng)用與其他種屬菌株復(fù)合發(fā)酵效果較好，主要與酵母菌、芽孢桿菌和乳酸菌等復(fù)合發(fā)酵，但其競(jìng)爭(zhēng)力較強(qiáng)與其它種屬菌株之間的協(xié)同頡頏作用研究較少，這也是導(dǎo)致絲狀真菌在發(fā)酵豆粕中應(yīng)用造成代謝產(chǎn)物、發(fā)酵指標(biāo)不理想等問(wèn)題的原因之一。相較于酵母、芽孢和乳酸菌工程菌構(gòu)建研究，絲狀真菌的工程菌構(gòu)建較少，其工程菌構(gòu)建的難度也較大，但這些絲狀真菌工程菌構(gòu)建工作意義重大。

絲狀真菌在發(fā)酵豆粕中應(yīng)用的潛力巨大，對(duì)絲狀真菌在發(fā)酵飼料開發(fā)上進(jìn)行深入和全面研究，不僅可為開發(fā)特殊功能性發(fā)酵豆粕提供理論基礎(chǔ)，而且還能為其他原料的開發(fā)和利用提供啟發(fā)式創(chuàng)新。