于 楊,郭文海,高藝書,韓玉生△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

骨骼肌損傷好發(fā)于四肌與臀部，以鈍挫傷或牽拉傷為主，外力的直接或間接作用引起肌纖維受到過度的壓力和牽拉，造成骨骼肌纖維斷裂，引起組織炎癥、水腫、變性和壞死等病理改變[1]。骨骼肌損傷后容易形成瘢痕修復(fù)，愈合所需時(shí)間長且極易導(dǎo)致再次損傷，骨骼肌損傷后再生修復(fù)研究成為國內(nèi)外熱點(diǎn)[2]。本研究觀察電針聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練對(duì)急性骨骼肌損傷模型大鼠神經(jīng)肌肉接頭相關(guān)蛋白nestin、Cdk5和ε-nAChR動(dòng)態(tài)表達(dá)的影響，探討其對(duì)骨骼肌損傷修復(fù)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量(250±20)g，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(魯)20140001，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室中正常喂養(yǎng)，室溫(24±2)℃，濕度55%～60%。

1.2 主要試劑及儀器

蛋白質(zhì)抽提試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購自賽諾博公司；nestin、Cdk5和ε-nAChR一抗購自CST公司；GAPDH抗體、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠/兔IgG、標(biāo)準(zhǔn)蛋白 marker等均購自武漢博士德生物工程有限公司。

2135型組織切片機(jī)(德國菜卡)；Moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)(美國Motic)；低溫高速離心機(jī)(科大創(chuàng)新);電泳儀、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移槽(北京六一儀器廠)；ThermoForma725(美國Forma公司)；凝膠成像系統(tǒng)(以色列MiniLumi公司)。

1.3 大鼠急性骨骼肌損傷模型制備

參考文獻(xiàn)[3-4]，大鼠稱重后用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射麻醉，右后肢用脫毛劑脫毛，大鼠俯臥右后肢外展且膝關(guān)節(jié)呈90°屈曲，固定充分暴露腓腸肌。打擊器鋼球重量200 g，下落高度100 cm，打擊部位腓腸肌中段面積1 cm2。造模后觀察打擊部位皮膚完整無破損，脛腓骨未發(fā)現(xiàn)骨折，局部組織出現(xiàn)腫脹等急性骨骼肌閉合性性損傷表現(xiàn)則為成功。

1.4 分組及干預(yù)方法

模型制備成功的大鼠隨機(jī)分為模型組與干預(yù)組，每組12只，再隨機(jī)分為7天與14天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只，另取6只大鼠為正常組。造模成功后，大鼠立即進(jìn)行制動(dòng)和冷敷5 min，2天后開始進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)。

干預(yù)組大鼠先進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練，跑臺(tái)速度15 m/min，時(shí)間15min，每日1次。跑臺(tái)訓(xùn)練后進(jìn)行電針干預(yù)，參照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物穴位圖譜[5-6]，大鼠固定后取局部損傷部位阿是穴、承山穴及承筋穴，局部常規(guī)消毒，使用0.25 mm×25 mm針灸針，針刺深度0.5 mm，連接電針儀，取疏密波，頻率2 Hz，強(qiáng)度0.4 mA，持續(xù)20 min，每日針灸1次。連續(xù)干預(yù)6天后休息1天。正常組與模型組不做任何處理。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 骨骼肌HE染色 在干預(yù)7天、14天于末次針刺30 min后，麻醉大鼠，取出損傷部位的腓腸肌浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。經(jīng)常規(guī)石蠟包埋后，進(jìn)行切片，HE染色，Motic3000顯微攝影系統(tǒng)在400倍鏡下進(jìn)行拍照，觀察骨骼肌病理學(xué)變化。

1.5.2 WB法檢測大鼠骨骼肌nestin、Cdk5和ε-nAChR蛋白表達(dá) 取液氮凍存的腓腸肌組織0.5 g放入預(yù)冷瓷研缽中,研磨成極細(xì)的粉末，用蛋白抽提試劑抽提出蛋白，經(jīng)BCA法蛋白定量后調(diào)整蛋白濃度，按WB步驟檢測nestin、Cdk5和ε-nAChR蛋白，上樣量為20 μg/孔，一抗?jié)舛染鶠?∶500，二抗?jié)舛?∶2 000。采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析, 以目的蛋白與對(duì)照蛋白光密度的比值作為目的蛋白的相對(duì)蛋白表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨骼肌病理變化

HE染色顯示,正常組大鼠骨骼肌纖維形態(tài)規(guī)整，肌細(xì)胞染色清晰，無斷裂、水腫和融解，未見充血和炎細(xì)胞浸潤。模型組7天時(shí)可見肌纖維斷裂，肌細(xì)胞腫脹融合，大量充血，炎癥細(xì)胞浸潤；14 h可見炎癥細(xì)胞浸潤明顯增加，結(jié)締組織增生明顯，局部可見肌纖維壞死區(qū)。與模型組相比較，干預(yù)組7天、14天時(shí)肌纖維排列較規(guī)整，炎細(xì)胞明顯減少，結(jié)締組織增生和壞死區(qū)明顯減少，新生肌纖維逐漸增多。見圖1。

2.2 各組大鼠骨骼肌中nestin蛋白的表達(dá)

與正常組比較，模型組及干預(yù)組大鼠骨骼肌中nestin蛋白表達(dá)帶明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，干預(yù)組大鼠骨骼肌中nestin蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。模型組和干預(yù)組7天時(shí)nestin蛋白表達(dá)明顯高于14天，呈下降趨勢。見表1、圖2。

表1 各組大鼠骨骼肌中nestin蛋白表達(dá)水平

注：與正常組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05。

2.3 各組大鼠骨骼肌中Cdk5蛋白的表達(dá)

與正常組比較，模型組及干預(yù)組大鼠骨骼肌中Cdk5蛋白表達(dá)帶明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，干預(yù)組大鼠骨骼肌中Cdk5蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.05)。模型組和干預(yù)組7天時(shí)Cdk5蛋白表達(dá)明顯高于14天，呈下降趨勢。見表2、圖2。

表2 各組大鼠骨骼肌中Cdk5蛋白表達(dá)水平

注：與正常組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05。

2.4 各組大鼠骨骼肌中ε-nAChR蛋白的表達(dá)

與正常組比較，模型組及干預(yù)組大鼠骨骼肌中ε-nAChR蛋白表達(dá)帶明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，干預(yù)組大鼠骨骼肌中ε-nAChR蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。模型組和干預(yù)組7天時(shí)ε-nAChR蛋白表達(dá)明顯低于14天，呈上升趨勢。見表3、圖2。

表3 各組大鼠骨骼肌中ε-nAChR蛋白表達(dá)水平

注：與正常組比較，*P<0.05;與模型組比較，#P<0.05。

注:A.正常組,B.模型組7 d,C.模型組14 d,D.干預(yù)組7 d,E.干預(yù)組14 d。圖2 各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠骨骼肌蛋白表達(dá)

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為急性骨骼肌損傷屬于“筋傷”范疇，鈍挫或牽拉等外力導(dǎo)致局部經(jīng)脈受損、氣機(jī)失利是其重要病理因素。早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有關(guān)于針刺治療筋傷的記載：“一針皮，二針肉，三針脈，四針筋”。研究表明電針能促進(jìn)骨骼肌損傷的修復(fù)進(jìn)程[7]。跑臺(tái)訓(xùn)練能夠提高NADH 還原酶蛋白表達(dá)，激活肌衛(wèi)星細(xì)胞來促進(jìn)損傷骨骼肌的修復(fù)[8]；電針聯(lián)合跑臺(tái)訓(xùn)練能夠更好地抑制瘢痕組織的形成，增加Agrin 蛋白表達(dá)，加速ACh受體聚合，從而促進(jìn)骨骼肌損傷后NMJ 的重建[4,9]。

骨骼肌損傷后機(jī)體會(huì)啟動(dòng)自我再生修復(fù)機(jī)制，增殖的成纖維細(xì)胞所形成的瘢痕組織阻礙周圍神經(jīng)對(duì)肌纖維的支配作用，造成骨骼肌電生理傳導(dǎo)功能障礙。神經(jīng)肌肉接頭(Neuromuscular junction,NMJ)是完成運(yùn)動(dòng)神經(jīng)與骨骼肌信號(hào)傳導(dǎo)的重要結(jié)構(gòu)和功能單位，NMJ功能的完整對(duì)電生理信號(hào)傳導(dǎo)和實(shí)現(xiàn)神經(jīng)對(duì)肌肉的支配具有重要意義[10]。分布于NMJ突觸后膜上的ε-nAChR特異性的表達(dá)于成熟的肌纖維中，能在極短時(shí)間內(nèi)結(jié)合大量Ach，引發(fā)神經(jīng)肌肉的電生理傳導(dǎo)，被認(rèn)為是NMJ損傷后電生理功能恢復(fù)的關(guān)鍵蛋白[11]。電生理信號(hào)傳導(dǎo)與NMJ周圍ACh受體簇集密切相關(guān)，ACh能通過nestin與Cdk5來抑制NMJ處ACh受體的簇集[12]，敲除Cdk5或nestin后Ach對(duì)其受體的解散作用被抑制，使細(xì)胞膜上的Ach受體大量表達(dá)；Cdk5或nestin過表達(dá)時(shí)，Ach對(duì)其受體的解散作用也增強(qiáng)，使Ach受體的表達(dá)相對(duì)減少[13]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，急性骨骼肌損傷大鼠ε-nAChR蛋白表達(dá)量明顯低于正常組，表明急性損傷對(duì)骨骼肌肉中ε-nAChR的表達(dá)有明顯抑制作用。干預(yù)組不同時(shí)間點(diǎn)ε-nAChR蛋白表達(dá)量逐漸升高，可能是電針聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練促進(jìn)了損傷區(qū)域生成新的骨骼肌細(xì)胞，從而進(jìn)一步生成大量的乙酰膽堿受體，促進(jìn)NMJ電生理功能的恢復(fù)。急性損傷后大鼠骨骼肌中Cdk5和nestin蛋白表達(dá)均明顯增加，電針聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練后nestin蛋白在7天、14天表達(dá)量均高于同時(shí)間點(diǎn)的模型組，而Cdk5蛋白表達(dá)逐漸降低。表明急性骨骼肌損傷能夠誘導(dǎo)Cdk5和nestin蛋白的表達(dá)，電針聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練能促進(jìn)骨骼肌中nestin蛋白的表達(dá)，抑制Cdk5蛋白的表達(dá)。

綜上所述，電針阿是穴、承山穴和承筋穴，同時(shí)配合一定量的跑臺(tái)康復(fù)訓(xùn)練能夠通過抑制骨骼肌Cdk5蛋白表達(dá)，上調(diào)nestin和ε-nAChR蛋白表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)肌肉接頭電生理功能的修復(fù)，從而改善大鼠骨骼肌急性損傷，表明電針聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練對(duì)急性骨骼肌損傷是一種有效的干預(yù)手段。