楊阿麗，劉欣，王興兵，汪安友，汪健

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院 血液內(nèi)科，安徽 合肥）

0 引言

急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）是一種常見的惡性血液病，目前主要治療方法是化療和造血干細(xì)胞移植。CD34+白血病細(xì)胞具有無限增殖、自我更新及多向分化的潛能，在體內(nèi)選擇性過度生長，并且干擾正常造血干細(xì)胞的分化，能逃逸大多數(shù)化療藥物的殺傷，處于相對靜息狀態(tài)的CD34+白血病細(xì)胞在體內(nèi)可以長期潛伏，化療不能完全消滅它[1]。目前有研究者認(rèn)為CD34+白血病細(xì)胞是白血病起源、治療后復(fù)發(fā)及耐藥的主要根源[2]。Toll樣受體（TLRs）作為模式識別受體中的一員，可以識別病原微生物的保守結(jié)構(gòu)分子模式，通過胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，促進抗原提呈細(xì)胞（APCs）的成熟以及誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[3],CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）參與機體免疫抑制功能，CD34+白血病細(xì)胞通過招募 Tregs并利用其功能來逃避機體的免疫監(jiān)視，在白血病發(fā)生過程中參與激活白血病特異性[4]，故推測通過干預(yù)Tregs細(xì)胞的增殖和免疫抑制功能將可作為CD34+白血病細(xì)胞清除的一個靶點。

本研究通過TLR-8激動劑在體外條件下干預(yù)前后，觀察負(fù)載CD34+白血病細(xì)胞的DC對CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的體外增殖及殺傷功能的影響。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 初發(fā)的急性白血病患者經(jīng)過骨髓細(xì)胞學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)免疫分型、染色體核型分析、融合基因（MICM）檢查確診，采用WHO診斷分型。入組8例AML（M3除外）患者，男性5例，女性3例，年齡23-55歲，中位年齡42歲，M1 1例，M2 1例，M4 2例，M5 4例。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

人淋巴細(xì)胞分離液：Solarbio公司；RPMI1640 培養(yǎng)基 ：美國Hyclone 生物科技有限公司。胎牛血清：杭州四季青公司；DMSO：美國Amresco公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶溶液：美國Hyclone生物科技有限公司；磁珠（CD34抗體和FcR阻斷劑，CD14抗體，CD8抗體、CD4抗體、抗生物素微球和CD25微球）：德國美天旎生物技術(shù)有限公司；去甲氧柔紅霉素：輝瑞制藥有限公司；硼替佐米：西安楊森制藥有限公司；IL-4、GM-CSF、TNF-α：美國PeproTech公司；VTX-2337：美國ImmunoWay公司；雙抗：青霉素、鏈霉素：賽業(yè)生物科技有限公司；冰醋酸、95%乙醇、75%乙醇、生理鹽水、PBS晶體：上海生工生物公司；CD14-PE、CD25-FITC、7AAD、CD4-PE、CD3-APC、CD8-FITC、CFSE：美國 BD公司；DC培養(yǎng)液：50mL RPMI1640 培養(yǎng)基加入5mL胎牛血清，加入青霉素、鏈霉素（雙抗?jié)舛染鶠?00U/mL），密封并置于4℃冰箱中保存；細(xì)胞凍存液：將DMSO與RPMI1640 培養(yǎng)基、血清按照1：7：3比例混合配置，配置為總體積為50mL的凍存液，封閉并并置于4℃冰箱中保存；PBS-E溶液：將PBS晶體溶于800mL蒸餾水中，調(diào)整pH為7.4左右，加蒸餾水定容至1000mL配成PBS溶液，每100mL溶液中加入1mLEDTA溶液，在高壓蒸汽滅菌器中滅菌至少30分鐘，室溫保存；PBS-EB溶液：取45mLPBS-E溶液加入200ul胎牛血清，冰水浴放置，磁珠分選時臨時配置用。

1.2.2 主要儀器

LS分選柱、MS分選柱、Mini MACS磁珠分選架：德國美天旎生物技術(shù)有限公司；流式細(xì)胞儀（FACSCanton Ⅱ型）：美國BD有限公司；倒置相差顯微鏡、顯微照相系統(tǒng)：日本Olympus公司；圖像分析系統(tǒng)：VideoTest Fish 2.0；低溫超速離心機、超凈工作臺：江蘇蘇凈集團安泰公司；CO2孵育箱:RSBiotech 公司。

2 方法

2.1 分選CD34+白血病細(xì)胞

2.1.1 細(xì)胞來源：簽署知情同意書后，采集2017-2019年安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院安徽省立醫(yī)院血液科初治AML（M3除外）患者的肝素抗凝的骨髓5mL。

2.1.2 提取單個核細(xì)胞并計數(shù)：將收集的骨髓用人淋巴細(xì)胞分離液采用密度梯度離心法提取單個核細(xì)胞并洗滌2次。棄上清，用手彈散底層細(xì)胞，加入RPMI1640至總體積5mL，混勻管內(nèi)細(xì)胞液。取10μL至EP管中，加190μL冰醋酸稀釋至20倍，充分分散細(xì)胞，吸取少許細(xì)胞懸液在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)，重復(fù)計數(shù)3次，取平均值。細(xì)胞數(shù)/mL=（四大格細(xì)胞總數(shù)/4）×104×稀釋倍數(shù)×細(xì)胞懸液總體（mL）。

2.1.3 磁珠分選CD34+白血病細(xì)胞：將2.1.2得到的單個核細(xì)胞離心、重懸后，在避光條件下加抗體阻斷劑FcR及CD34+抗體磁珠，進行磁珠陰性分選，獲得即為CD34+白血病細(xì)胞。

2.1.4 CD34+白血病細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇：將分選的CD34+白血病細(xì)胞凍存并保存于液氮罐中，待該患者達到完全緩解期時復(fù)蘇備用。

2.2 樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)

2.2.1 細(xì)胞來源：簽署同意書后，多次累計采集完全緩解期患者的外周血20mL，提取單個核細(xì)胞（PBMC）并計數(shù)，用CD14+抗體磁珠陰性分選獲得CD14+單個核細(xì)胞，用作DC（步驟同2.1.2-2.1.3）。

2.2.2 培養(yǎng)成熟DC：用含10% FBS、1U/mL青霉素、1μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液將分選的單核細(xì)胞的濃度調(diào)整為2×106/2mL，置于6孔培養(yǎng)板中， 加入GM-CSF 1000 U/mL、IL-4 500 U/ mL（每孔液體量調(diào)為2mL），均勻吹打細(xì)胞，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48小時觀察細(xì)胞形態(tài)，半量換液及添加細(xì)胞因子，第5天再次半量換液，加入TNF-α 50 U/mL，繼續(xù)5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，收集細(xì)胞，獲得成熟DC。

2.2.3 成熟DC的凍存與復(fù)蘇：將2.2.2獲取的細(xì)胞液移至離心管中，向每孔加入37℃預(yù)熱的0.25%胰酶，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中消化5分鐘，待細(xì)胞充分消化后，向每孔加入2mL RPMI 1640培養(yǎng)液以停止細(xì)胞消化，收集成熟DC于無菌離心管中，凍存與復(fù)蘇同2.1.4。

2.3 制備負(fù)載CD34+白血病細(xì)胞的DC

復(fù)蘇凍存的CD34+的白血病細(xì)胞于6孔板中，加入RPMI 1640培養(yǎng)液，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，加入去甲氧柔紅霉素（15ng/mL）聯(lián)合硼替佐米（0.25μM），培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18小時，收集細(xì)胞。冰上孵育30分鐘后，洗滌2次，與DC按1：2混合培養(yǎng)2小時，收集細(xì)胞。

2.4 CTL 的生成

多次累計取完全緩解期患者外周血10mL，分離外周血單個核細(xì)胞（PBMC），將負(fù)載CD34+白血病細(xì)胞的DC與分離的PBMC按1：2共培養(yǎng)，第7天和第14天加入DC反復(fù)刺激。同時，從第3天起，每隔2-3天加入IL-2（20IU/mL）。第21天，采用磁珠陽性分選獲得CD8+CTL。

2.5 CD4+CD25+T 細(xì)胞分選

多次累計取完全緩解期患者外周血10mL，分離外周血單個核細(xì)胞（PBMC），磁珠分選出CD4+T細(xì)胞，再通過抗CD25的磁珠分選獲得將CD4+CD25+T細(xì)胞。

2.6 誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞增殖作用的檢測

在6孔板中加入負(fù)載藥物誘導(dǎo)凋亡CD34+白血病細(xì)胞的DC和 CFSE（2.5μmol/L）標(biāo)記 CD4+CD25+T細(xì)胞（2×105個 / 2mL）按照10：1共培養(yǎng)，分為兩組：1）對照組：僅加入含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液；2）TLR-8激動劑組：加入含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液及 TLR-8激動劑（VTX-2337，3μg/mL），分別于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7天后，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+T調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖情況。

2.7 TLR-8 激動劑干預(yù)下CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞對CTL 殺傷CD34+白血病細(xì)胞作用的影響檢測

2.7.1 TLR-8激動劑（VTX-2337）預(yù)處理CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞：分選的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（2×105個/2mL）在含有TLR-8激動劑(VTX-2337，3μg/mL)的介質(zhì)中培養(yǎng)3天，洗滌后，用于下述試驗。

2.7.2 殺傷實驗：自體CD34+白血病細(xì)胞作為靶細(xì)胞，在5%CO2，37℃ 條件下用終濃度為2.5μmol/L的CFSE標(biāo)記10min。洗3次去除殘余的染料，并懸浮于完全培養(yǎng)基中。實驗用U型96孔板，分為3組：1）空白組（單獨靶細(xì)胞組）：靶細(xì)胞（自體CD34+白血病細(xì)胞）100μL，2）對照組：加入TLR-8激動劑（VTX-2337）預(yù)處理前CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞（CD8+CTL）和靶細(xì)胞（自體CD34+白血病細(xì)胞）各100μL，每孔均加900個靶細(xì)胞，效靶比分別為12.5:1、25:1，設(shè)置3個平行復(fù)孔；3）TLR-8激動劑組：加入TLR-8激動劑（VTX-2337）預(yù)處理后CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞（CD8+CTL）和靶細(xì)胞（自體CD34+白血病細(xì)胞）各100μl， 每孔均加900個靶細(xì)胞，效靶比分別為25:1、 12.5:1，設(shè)置3個平行復(fù)孔。120g離心2分鐘，于5%CO2，37℃孵育4小時。共孵育結(jié)束后，加入5μL 7AAD（100μg/mL）置于冰浴5min，采用流式細(xì)胞術(shù)分析，測定CD8+CTL的殺傷功能。公式如下：殺傷活性（%）=7AAD/CFSE×100%。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 25.0進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果均用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)比較在方差齊性時采用方差分析，兩兩比較采用T檢驗，應(yīng)用FlowJo軟件分析流式結(jié)果，Graphpad prism 5軟件作圖，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測TLR-8 激動劑對調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞增殖影響

對照組CD4+CD25+T細(xì)胞增殖活性為23.73%±3.36%，TLR-8激動劑組CD4+CD25+T細(xì)胞增殖活性為2.95%±1.23%，P＜0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，TLR-8激動劑組CD4+CD25+T細(xì)胞增殖活性較對照組顯著下降，提示TLR-8激動劑明顯抑制了CD4+CD25+T細(xì)胞的增殖活性。如圖1、圖2。

圖1 對照組和TLR-8 激動劑組 CD4+CD25+ regulatory T 增殖活性比較。結(jié)果提示TLR-8 激動劑明顯抑制了 CD4+CD25+ regulatory T 的增殖活性，P＜0.01。

圖2 對照組和TLR-8 激動劑組 CD4+CD25+ regulatory T 增殖活性比較

3.2 流式檢測TLR-8 激動劑通過CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞對CTL 殺傷CD34+白血病細(xì)胞作用的影響

效靶比12.5：1組對照組殺傷率為13.81%±1.77%，TLR-8激動劑組殺傷率為46.98±7.98%，P＜0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，效靶比25：1組對照組殺傷率為27.15%±5.99%，TLR-8激動劑組殺傷率為50.88±8.83%，P＜0.01，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，TLR-8激動劑組CTL殺傷功能較顯著增強，提示TLR-8激動劑明顯抑制了CD4+CD25+T細(xì)胞免疫抑制功能，進而提高CTL殺傷功能。如圖 3、圖 4、圖 5、圖 6、圖 7。

圖3 空白組

圖4 效靶比12.5：1 下，對照組和TLR-8 激動劑組CTLs 的殺傷率比較。結(jié)果提示TLR-8 激動劑明顯增加了CTLs 的殺傷率，P＜0.05。

圖5 效靶比12.5：1 下，對照組和TLR-8 激動劑組CTLs 的殺傷率比較。

圖6 效靶比25：1 下，對照組和TLR-8 激動劑組CTLs 的殺傷率比較。結(jié)果提示TLR-8 激動劑明顯增加了CTLs 的殺傷率，P＜0.05。

圖7 效靶比25：1 下，對照組和TLR-8 激動劑組CTLs 的殺傷率比較。

4 討論

AML占急性白血病的80%，隨后發(fā)現(xiàn)幾乎各類 AML 亞型中都存在 CD34+CD38-的LSC，它們約占整個AML細(xì)胞群的0.1%-1%，有學(xué)者提出針對 LSC 表面特異性標(biāo)志物的靶向治療可選擇性清除AML細(xì)胞及 LSCs，而不損傷正常造血干/祖細(xì)胞[5]，為白血病治療提供新的思路，拓寬了白血病治療的途徑。

DC是具有強大功能的APC， TLRs在DC、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、黏膜上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等均有表達，其中TLR-8結(jié)合配體后，通過 MyD88 信號通路活化 TLR-8下游分子，如 IRAK、NF-κB、MAPK 等，引起 Th1細(xì)胞因子基因表達[6,9]，促進 Th1 細(xì)胞因子的分泌。Peng 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，TLR-8 通過識別配體觸發(fā)TLR8-MyD88-IRAK4 信號活化途徑抑制 Tregs細(xì)胞進而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，人們嘗試?yán)妹庖咦魟┗蛲ㄟ^體外培養(yǎng)方法制備DC 疫苗，用于促進 DC 的成熟，增強機體的免疫反應(yīng)。大量研究證實無論是不成熟的DC還是成熟的DC均可誘導(dǎo)具有抑制功能的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生成。如果在接種負(fù)載腫瘤抗原的DC之前，利用抗-CD25抗體去除CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，則可有效地增強 DC的抗腫瘤免疫應(yīng)答[8]。有研究表明TLR-8激動劑可直接阻斷CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制功能，增強CTL 的抗腫瘤免疫功能[7]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TLR-8激動劑干預(yù)下，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖活性明顯下降，在殺傷實驗中，CTL殺傷能力明顯增強。Ye等學(xué)者[10]研究證明腫瘤衍生的內(nèi)源性cAMP是介導(dǎo)腫瘤誘導(dǎo)T細(xì)胞衰老的重要介質(zhì)，并探討了TLR-8 配體 poly -G3 預(yù)防腫瘤誘導(dǎo)的T細(xì)胞衰老的作用是由于降低腫瘤細(xì)胞中的cAMP水平，poly- G3處理后腫瘤細(xì)胞中的cAMP水平顯著降低。Dietsch等研究者[11]利用VTX-2337來刺激THP-1細(xì)胞和人PBMC后發(fā)現(xiàn)可以增強NK細(xì)胞活性，從而增加曲妥單抗、利妥昔單抗、西妥昔單抗等調(diào)節(jié)的ADCC，并通過 TLR-8 信號通路誘導(dǎo) IL-1β、IL-18 的分泌。TLR-8激動劑通過結(jié)合其配體后介導(dǎo)T細(xì)胞衰老并增強體內(nèi)ADDC。本研究中VTX-2337是通過結(jié)合其配體，干預(yù)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖和腫瘤抑制能力，從兩個方向增強腫瘤細(xì)胞的清除功能，因此認(rèn)為TLR-8激動劑可作為DC的免疫佐劑，提高體內(nèi)DC抗腫瘤能力，在今后腫瘤免疫治療方面有臨床應(yīng)用前景。