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不同品種谷子種子愈傷組織再生體系的建立

2020-04-22 15:02尹藝臻馬春英王曉璐王玉玲溫銀元原向陽
山西農(nóng)業(yè)科學 2020年4期
關(guān)鍵詞:谷子分化培養(yǎng)基

尹藝臻,馬春英,王曉璐,王玉玲,溫銀元,原向陽,趙 娟

(山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院,山西太谷030801)

谷子(Setar italica Beauv)為一年生禾本科狗尾 草屬植物,是我國的傳統(tǒng)作物和環(huán)境友好型作物,其具有營養(yǎng)豐富、水分利用效率高、抗逆性強、基因組穩(wěn)定等特點,是我國北方干旱、半干旱地區(qū)重要的區(qū)域性特色雜糧作物;其蛋白質(zhì)、維生素、脂肪以及鈣、磷、鐵、硒等微量元素含量豐富,已被列入國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系,在我國的糧食安全中起重要作用。同時,谷子秸稈營養(yǎng)較均衡,纖維素含量少,又是較好的飼料作物[1-13]。

建立穩(wěn)定高效的再生體系是分子生物學相關(guān)技術(shù)在谷子上開展應用的前提條件和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。關(guān)于谷子的組織培養(yǎng)已開展了大量的研究工作,日本學者BAN等[14]最早于20世紀70年代開始研究谷子組培,在含有2,4-D和KT的Blaydes培養(yǎng)基上培養(yǎng)谷子花藥獲得成功。RANGAN等[15]也成功地誘導出谷子的愈傷組織,同時獲得了再生植株。VASIL[16]和MARRISH[17]研究了谷子原生質(zhì)體懸浮培養(yǎng)和胚性愈傷組織的培養(yǎng),并取得了成功。RAO等[18]用成熟胚作為外植體培養(yǎng)獲得愈傷組織和再生植株,發(fā)現(xiàn)谷子不同基因型再生能力存在差異。國內(nèi)學者許智宏等[19]利用谷子與狗尾草的幼穗作為外植體獲得了谷子的再生植株。趙連元等[20]和刁現(xiàn)民等[21]在谷子原生質(zhì)體和體細胞無性系的組織培養(yǎng)試驗中均成功培養(yǎng)出理想材料。周俊彥等[22]用云南狗尾草×谷子(4n)的F1獲得愈傷組織,并獲得再生植株。張樹錄等[23]利用谷子的幼穗培養(yǎng)獲得愈傷組織,并獲得再生植株。許多學者以多種谷子材料(原生質(zhì)體、愈傷組織、葉片、莖尖端、幼胚、成熟種子等)為外植體進行研究,均獲得了大量成熟的再生植株[24-26]。王曉璐等[27]研究了不同種類植物激素及濃度配比對晉谷21號谷子種子愈傷組織的誘導與植株再生的影響。狗尾草(Setaria viridis)為谷子的近緣野生種,其組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化方面的研究已獲得了成功,為谷子相關(guān)研究提供了借鑒[28-29]。

有學者研究不同植物組織培養(yǎng)再生體系的建立中發(fā)現(xiàn),不同基因型、不同外植體、不同激素種類、不同濃度配比等對其再生效率均有較大的影響[3,30-33]。谷子種子相比于現(xiàn)有谷子組織培養(yǎng)方面的報道中谷子幼穗、幼胚等外植體材料具有可儲存且不受季節(jié)、地理環(huán)境和發(fā)育階段的限制等特點,是一種較為理想的谷子再生體系建立的材料[3]。

本試驗選用3個品系的6個谷子品種的種子為外植體,對培養(yǎng)基成分以及基因型對谷子成熟胚愈傷組織誘導和分化的影響進行了研究,旨在為遺傳轉(zhuǎn)化在谷子上的應用及開展谷子的相關(guān)研究工作提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料晉谷29號、晉谷61號、張雜谷10號、張雜谷16號、冀谷39號、冀谷41號等6個品種谷子種子均由山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院谷子創(chuàng)新團隊提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒 挑選6個谷子品種干凈、飽滿的成熟種子作為外植體,滅菌方法參照文獻[27]進行。

1.2.2 愈傷組織的誘導 將經(jīng)過滅菌處理的6個品種的谷子種子接種到附加有不同濃度2,4-D(1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L)和 6-BA(0.2 mg/L)的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上,每瓶接種7粒種子,每個處理接種10瓶,(25±1)℃下進行暗培養(yǎng)。接種4 d后,統(tǒng)計種子的萌發(fā)率;接種21 d后,統(tǒng)計愈傷組織的誘導率。

1.2.3 愈傷組織的分化 篩選誘導獲得的優(yōu)質(zhì)愈傷組織接種到附加有不同濃度6-BA(1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L)和 NAA(0.5 mg/L)的分化培養(yǎng)基中,每瓶接種5個愈傷組織,每個處理接種12瓶,在(25±1)℃、光照時間 15 h/d、2 000~3 000 lx光強下培養(yǎng)30 d,觀察愈傷組織的生長和分化情況,并統(tǒng)計愈傷組織分化率。

1.2.4 試管苗的生根 選取生長健壯的分化苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上(MS、1/2 MS(大量和微量減半)和MS+1.0 mg/LNAA),每瓶接種5株,每個處理接種 12瓶,在(25±1)℃、2 000~3 000 lx條件下培養(yǎng)30 d,觀察試管苗的生根情況,并統(tǒng)計生根率。

1.2.5 培養(yǎng)基情況 愈傷組織的誘導和分化以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基;生根培養(yǎng)基以MS或1/2 MS(大量和微量減半)為基本培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基均附加蔗糖30 g/L,瓊脂5 g/L,pH值為5.6~5.8。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行多重比較和方差分析。

種子萌發(fā)率=種子的萌發(fā)數(shù)/接種的種子總數(shù)×100% (1)

愈傷組織誘導率=誘導的愈傷組織種子數(shù)/接種的種子總數(shù)×100% (2)

愈傷組織分化率=分化幼苗的愈傷組織數(shù)/誘導的總愈傷組織數(shù)×100% (3)

生根率=生根試管苗/試管苗總數(shù)×100%(4)

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度2,4-D與6-BA配比對谷子種子萌發(fā)的影響

從表1可以看出,MS培養(yǎng)基中附加2,4-D 1.0 mg/L、6-BA 0.2 mg/L時,晉谷 29號(22.86%)、張雜谷10號(60.00%)和張雜谷16號(64.28%)谷子種子的萌發(fā)率達到最大,附加2,4-D 2.0 mg/L、6-BA 0.2 mg/L時,晉谷61號(95.71%)、冀谷39號(51.43%)和冀谷41號(82.86%)種子的萌發(fā)率達到最大。總體來看,隨著2,4-D濃度的增加6種谷子的種子萌發(fā)率呈現(xiàn)出不同的變化趨勢,說明2,4-D對谷子種子的萌發(fā)在不同品種間存在一定差異。

主體間效應檢查結(jié)果表明(表2),在P=0.05水平上,不同品種對種子的萌發(fā)率具有極顯著的差異,不同培養(yǎng)基對種子的萌發(fā)率沒有顯著性差異;F 值表現(xiàn)為品種(187.428)>培養(yǎng)基(1.411),表明2種因素對種子萌發(fā)率作用的主次關(guān)系為品種大于培養(yǎng)基。

表1 2,4-D與6-BA配比對不同品種谷子萌發(fā)的影響

表2 不同品種谷子種子萌發(fā)率方差分析

2.2 不同濃度2,4-D與6-BA配比對谷子種子愈傷組織誘導的影響

將6個品種谷子種子分別接種到含有不同濃度2,4-D和6-BA配比的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上,觀察并比較種子愈傷組織的誘導率,結(jié)果表明(表3),6個品種的谷子種子愈傷組織誘導率在不同配比2,4-D和6-BA的培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出不同的變化趨勢,其中,MS培養(yǎng)基中附加2,4-D 1.0 mg/L和6-BA 0.2 mg/L時,晉谷 61號(100.00%)、張雜谷10號(60.00%)和張雜谷16號(65.71%)谷子種子的愈傷組織誘導率均達到最大,但隨著2,4-D濃度的增加,這3種谷子種子的愈傷組織誘導率的變化趨勢有所不同,晉谷61號愈傷組織誘導率先保持不變后降低,但愈傷組織褐化速度加快,張雜谷10號呈現(xiàn)出先降低再升高的趨勢,張雜谷16號則隨著2,4-D濃度的增加表現(xiàn)出先降低再增高再降低的趨勢;MS培養(yǎng)基中附加2,4-D 2.0 mg/L和 6-BA 0.2mg/L時,晉谷29號(51.43%),冀谷39號(58.57%)和冀谷41號(84.29%)種子的愈傷組織誘導率達到最大,且隨著2,4-D濃度的增加,這3種谷子種子的愈傷組織誘導率的變化趨勢也有所不同,其中,晉谷29號和冀谷41號均呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢,但冀谷39號則表現(xiàn)為先升高再降低再升高的趨勢。結(jié)果表明,2,4-D濃度對谷子種子愈傷組織誘導的影響較大,濃度過高或過低都會影響愈傷組織的誘導;且不同品種谷子種子對2,4-D的濃度要求不同(圖1)。

表3 不同2,4-D與6-BA配比對不同品種谷子愈傷組織誘導的影響

主體間效應檢查結(jié)果表明(表4),在P=0.05水平上,谷子品種不同對種子愈傷組織誘導率具有極顯著差異,培養(yǎng)基的不同對谷子愈傷組織誘導率沒有顯著性差異;F值表現(xiàn)為品種(183.049)>培養(yǎng)基(3.039),表明2種因素對谷子愈傷組織的誘導率作用的主次關(guān)系為品種大于培養(yǎng)基。

表4 不同品種谷子種子愈傷組織誘導率方差分析

2.3 不同濃度6-BA與NAA配比對谷子愈傷組織分化的影響

由表5可知,6種谷子愈傷組織的分化率在不同培養(yǎng)基和不同品種間均存在顯著差異,除冀谷39號外,其他品種愈傷組織均在MS附加1.0 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基上分化率達到最大,并隨著6-BA濃度的增加,愈傷組織的分化率有所降低,且分化率的最大值在各品種間存在顯著差異,其中,張雜谷16號分化率最高,達25.00%,晉谷29號最低,僅為3.33%;冀谷39號則在MS附加2.0 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基上分化率達到最大(13.33%)(圖 2)。

方差分析從主體間效應檢查可以得出(表6),在P=0.05水平上,谷子品種差異對愈傷組織分化率影響具有極顯著的差異,培養(yǎng)基差異對愈傷組織分化率影響差異不顯著;F值表現(xiàn)為品種(13.253)>培養(yǎng)基(3.084),表明2種因素對谷子愈傷組織的分化率作用的主次關(guān)系為品種大于培養(yǎng)基。

表5 不同6-BA與NAA配比對不同種類谷子愈傷組織分化的影響

表6 不同品種谷子愈傷組織分化的方差分析

2.4 不同種類培養(yǎng)基對分化苗生根的影響

表7 不同種類培養(yǎng)基對分化苗生根的影響

將生長健壯的6個品種谷子試管苗分別接種到MS、1/2MS(大量和微量減半)和MS附加1.0 mg/L NAA的3種培養(yǎng)基上,培養(yǎng)21~28 d后,結(jié)果表明,試管苗在這3種培養(yǎng)基上均可生根,但在1/2 MS(大量和微量減半)和MS附加1.0 mg/LNAA這2種培養(yǎng)基較MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基誘導出的根更粗壯、試管苗的長勢更好,尤其在1/2 MS(大量和微量減半)培養(yǎng)基上誘導出的根黃白且粗壯、試管苗生長健壯,適合移栽(表 7、圖 3)。

3 結(jié)論與討論

近幾年,大量研究者開展了谷子組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的研究,谷子基因型通過其遺傳學特性決定著分化機制及影響分化再生的進程,其對谷子愈傷組織誘導和再生的作用顯著大于培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件,是影響谷子高效再生體系建立的內(nèi)因。袁進成等[3]研究了冀谷11號、豫谷2號、鐵谷5號和十里香4個谷子品種成熟胚的再生能力及其影響因素,結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同品種的成熟胚誘導愈傷和愈傷分化能力不同,基因型對谷子的再生能力影響較大。RAO等[18]用成熟胚作為外植體獲得了愈傷組織和再生植株,并證明谷子不同基因型再生能力存在差異。李顏方等[34]研究發(fā)現(xiàn),不同谷子基因型其愈傷組織誘導率和植株再生率存在較大差異。王寒玉等[35]采用谷子莖尖作為外植體進行愈傷誘導試驗,結(jié)果表明,不同基因型的谷子對2,4-D的濃度要求不同,其各自在最適的2,4-D濃度下才有較高的愈傷組織誘導效率。本試驗結(jié)果表明,在所設(shè)置的各培養(yǎng)基中,不同品種谷子達到最高的種子萌發(fā)率(晉谷29號20.72%、晉谷61號92.50%、張雜谷10號57.86%、張雜谷16號57.14%、冀谷39號45.36%、冀谷41號80.00%)、愈傷組織誘導率(晉谷29號47.14%、晉谷61號99.65%、張雜谷10號58.21%、張雜谷16號60.00%、冀谷39號50.71%、冀谷41號82.86%)和愈傷組織分化率(晉谷29號1.25%、晉谷61號3.33%、張雜谷10號2.09%、張雜谷16號19.58%、冀谷39號7.08%、冀谷41號10.83%)均存在顯著的差異;通過主體效應分析發(fā)現(xiàn),谷子愈傷組織的誘導和分化在品種間存在顯著差異,這與已有研究結(jié)果一致,表明基因型是影響谷子穩(wěn)定高效離體再生體系建立的首要因素。

同一基因型的谷子,不同激素的種類和濃度配比對誘導出的愈傷組織質(zhì)量有很大的影響。王曉璐等[27]采用晉谷21號谷子成熟種子作為外植體進行愈傷組織誘導及植株再生的試驗,結(jié)果表明,在MS培養(yǎng)基中附加2,4-D對于愈傷組織誘導的效果優(yōu)于NAA,同時加入適合濃度的6-BA可以提高愈傷組織的質(zhì)量,6-BA誘導愈傷組織分化的效果優(yōu)于ZT。本試驗在所設(shè)置各激素配比條件下,各品種間愈傷組織誘導率差異顯著,但均較高,晉谷29號誘導率最低也達到了47.14%;但各品種的分化率均較低,張雜谷16號分化率最高也僅為19.58%。可見,谷子高效再生體系建立的另一個關(guān)鍵在于愈傷組織分化率的提高,須通過對激素濃度配比、附加物等進行細致篩選。

谷子試管苗較易生根,ANJALI等[36]以不同濃度的萘乙酸(0、1.0、2.0、3.0 mg/L)和芐基氨基嘌呤(0、1.0 mg/L)誘導生根,結(jié)果表明,在不含植物激素的MS培養(yǎng)基上,繼代培養(yǎng)10 d后生根效果最佳,MS培養(yǎng)基中生長素或細胞分裂素的存在完全抑制了根系的誘導。本試驗中,谷子試管苗在所設(shè)置的3種培養(yǎng)上均可生根,但生根效果有所差別,以在不含植物激素的1/2 MS(大量和微量減半)培養(yǎng)基上生根黃白且粗壯,試管苗生長健壯,適合移栽,與ANJALI等[36]的研究結(jié)果基本一致。

本試驗通過主體效應分析發(fā)現(xiàn),谷子愈傷組織的誘導和分化在品種間存在顯著差異,谷子基因型對谷子愈傷組織誘導和植株再生的影響顯著大于培養(yǎng)基和條件,基因型是影響谷子高效再生體系建立的內(nèi)因和首要因素。建立谷子高效再生體系的另一個關(guān)鍵因素在于提高愈傷組織分化率,須通過對激素濃度配比、附加物等影響因素進行細致篩選。谷子試管苗易生根,在不含植物激素的MS培養(yǎng)基上生根效果最佳。篩選適合建立穩(wěn)定高效再生體系的谷子基因型及適宜培養(yǎng)基和條件,可有效促進相關(guān)生物技術(shù)在谷子上的應用。

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