張 豪 ，武國瑞 ，楊萬明 ，杜維俊 ，趙晉忠 ，岳愛琴 ，張永坡 ，高春艷 ，王 敏

（1.山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太谷030801；2.晉中學院生物科學與技術學院，山西晉中030600；3.山西農(nóng)業(yè)大學文理學院，山西太谷030801）

天然食用色素作為一類重要、較為安全的食品添加劑，應用于食品已有幾個世紀的歷史[1]。其中，花色苷、原花青素、黃酮、類胡蘿卜素和葉綠素因其營養(yǎng)與保健功能而被廣泛應用[2-4]，這在當今社會愈加明顯。大豆種皮富含有豐富的顏色，如黃色、綠色、棕色和黑色[5]，可以作為一種或多種天然色素的潛在來源。大豆種皮相比于胚和子葉，擁有更多的色彩，研究意義更大。本研究以16份不同顏色大豆種子為材料，從種皮色素含量和種皮顏色指標方面，利用相關分析、主成分分析、聚類分析對不同大豆品種種皮色素指標進行綜合評價，以期為大豆品質(zhì)育種及品質(zhì)資源鑒定與篩選提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

表1 供試大豆品種及種皮顏色

大豆種皮色按標準分成5類，但是實際種皮顏色是漸變的。通過野生與栽培大豆雜交構建的重組自交系群體后代可表現(xiàn)出種皮顏色連續(xù)的漸變。本研究選取13份重組自交系群體后代（JP）和3份純色（黃、綠、黑）大豆資源為試驗材料（表1），共計16份材料，幾乎涵蓋了所有可能的大豆種皮色。各品種種子均在山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)作站進行繁育。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆種皮色的測定 采用WSC-80C全自動色差計測量大豆種皮的顏色。每個品種隨機選取5粒，用種皮的中間部分對準色差儀的集光孔進行測量，最后取平均值。色度（C）＝（a＋b）1/2，C值表示到亮度軸上的距離，即距離越遠，C值越大[6-7]。

1.2.2 大豆種皮色素含量的測定 手工剝?nèi)「鞔蠖狗N皮，冷凍干燥后粉碎過0.25 mm篩，然后加入20 mL石油醚振蕩脫脂24 h，最后放于4℃冰箱中儲藏備用。采用pH示差法測定種皮的花色苷含量[8]。采用Al（NO3）3絡合分光光度法測定種皮總黃酮的含量[9]。利用香草醛-鹽酸法測定種皮的原花青素含量[10]。參照文獻[11]測定種皮的類胡蘿卜素含量[11]。參照文獻[12]測定種皮的葉綠素含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS軟件對各色素指標數(shù)據(jù)進行顯著性分析、主成分分析、聚類分析和相關性分析，并計算F值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種皮色大豆色素含量的比較分析

表2 不同種皮色大豆色素含量的差異

由表2可知，9個性狀均在品種間存在顯著差異，且達到極顯著水平（P＜0.01）。16份大豆品種中，SZ874種皮中的花色苷含量最高，達到10.27 mg/g，且與其他種皮色大豆達到了顯著差異，其種皮的L值、a值、b值和 C值很低，分別為 21.05、-2.11、1.36和2.58，使該種皮色呈現(xiàn)為黑色啞光。JP381的花色苷含量較高，達到6.92 mg/g，與除SZ874外其他種皮色大豆達到了顯著差異，種皮表現(xiàn)為亮黑色?；ㄉ?苷 含 量 較 小 的 品 種 有 JP394、JP400、JP331、JP356，花色苷含量依次下降且互相之間均差異顯著，其余大豆花色苷含量極少，互相之間差異不顯著，且PB2438種皮中完全檢測不到花色苷，但是其種皮的L值、b值和C值卻達最高，分別為56.96、32.98和34.76，該種皮色為黃色，表明黃色大豆中不含花色苷。與花色苷趨勢相同，SZ874種皮原花青素的含量亦最高，與其他種皮色大豆達到了顯著差異，原花青素較高的有 JP381、JP357、JP360、JP372、JP394和JP331，且相互間差異達顯著水平，其余9個大豆品種的原花青素含量極低，在0～0.50 mg/g，PB2438種皮亦檢測不到原花青素。16個大豆品種的總黃酮差異十分明顯，其中，以JP357、JP381、SZ874和JP360種皮的總黃酮含量較高，均在100 mg/g以上，亨特指標值相對偏低，這4個品種的種皮為紅棕色或黑色，表明顏色深的大豆品種總黃酮含量較高；JP394、JP400、JP372、JP331 和 JP374的總黃酮含量居中，在15.92～71.31 mg/g，它們的種皮顏色大多為棕色，其余7個大豆品種的總黃酮含量則相對較低，均不超過12 mg/g，這些大豆種皮顏色較淺，亨特指標中L值比較大，均在30以上，可見種皮顏色和總黃酮含量呈正相關關系，基本是種皮顏色越深，越暗沉，總黃酮含量越高的趨勢。各大豆品種的類胡蘿卜素含量在2.90～10.30mg/100g，其中JP392、SZ874的含量最高，種皮色為黑黃色，與其他材料差異顯著，其次為JP357和JP394，種皮色為棕褐色，JP373的含量最低。葉綠素含量最高的為JP392，與其他材料差異顯著，其次為JP372和JP374，PB2438和JP400的含量極低，只有0.05mg/g。綜上所述，種皮顏色和各色素含量之間有著密切的關系。

2.2 不同色素含量的相關分析

從表3可以看出，大豆種皮花色苷含量、原花青素和總黃酮含量3個指標間均呈極顯著正相關關系，表明3個指標受相同基因的控制或具有相同的代謝途徑。此外，類胡蘿卜素含量與原花青素含量和葉綠素含量呈顯著正相關關系。L值與b、C值呈極顯著正相關關系，與原花青素和總黃酮含量呈極顯著負相關，與花色苷和類胡蘿卜素含量呈顯著負相關，表明大豆種皮越黯淡，其原花青素和總黃酮含量越高，種皮越有光澤，花色苷和類胡蘿卜素含量越低。b值與C值呈顯著正相關，且b值跟C值都與花色苷含量、原花青素和總黃酮含量呈顯著或極顯著負相關關系，表明大豆種皮越黃，其原花青素、花色苷和總黃酮含量越低。a值只與花色苷含量呈顯著負相關。

表3 色素指標間的相關性分析

2.3 不同色素含量的主成分分析

對16份大豆品種的9個指標進行主成分分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前4個主成分的方差貢獻率累積達到95.92%，這說明這4個主成分可以代表9個指標的大部分信息（表4）。在主成分1中，花色苷含量、原花青素含量和總黃酮含量具有正向載荷，L值、b值和C值具有負向載荷，且這6個指標載荷系數(shù)的絕對值較大，說明花色苷含量高、原花青素含量高、總黃酮含量高、種皮色澤黯淡、種皮偏深色，顏色飽和度低是第1主成分的主導因子，有利于大豆種皮品質(zhì)改良。而在主成分2中，類胡蘿卜素含量、葉綠素含量和a值的載荷系數(shù)絕對值較大，均為正向載荷，主要表現(xiàn)為類胡蘿卜素含量多、葉綠素含量高和種皮顏色偏綠，是第2主成分的主導因子。第1主成分和第2主成分中涉及的主導因子覆蓋全部9個指標，說明這2個主成分具有可靠的代表性。在主成分3中，總黃酮含量、類胡蘿卜素含量、葉綠素含量和a值的載荷系數(shù)較大，是第3主成分的主導因子，其中，總黃酮含量和a值是正向載荷，類胡蘿卜素含量和葉綠素含量是負向載荷。說明總黃酮含量高、種皮色澤黯淡、種皮偏綠、類胡蘿卜素含量和葉綠素含量低是第3主成分的主導因子。第4主成分的主導因子是花色苷含量、原花青素含量、L值、a值和b值，它們對第4主成分均為正向載荷。這表現(xiàn)為花色苷含量高、原花青素含量高、種皮色澤黯淡、種皮偏黃綠是第4主成分的主導因子。

表4 色素含量的主成分分析

2.4 不同種皮色大豆的聚類分析

針對種皮的9個指標，對其綜合指標進行聚類分析（圖1），且在歐式距離2.00處將16份大豆品種分成 4 類，第一類：JP374、JP392、JP372、JP331 和JP419，該類大豆種皮色顏色較淺或呈雙色；第二類：JP356、SP44、JP373、JP375 和 PB2438，該類種皮顏色較淺，均為黃綠色；第三類：JP400、JP394、JP357和JP360，該類大豆種皮均呈棕褐色；第四類JP381和SZ874（圖1），該類種皮均為黑色。

2.5 不同類型大豆色素含量的特征分析

基于聚類分析的結(jié)果（表5），對不同顏色種皮色素含量分析發(fā)現(xiàn)，第四類大豆花色苷和原花青素含量極顯著高于其他三類大豆，表現(xiàn)為黑色種皮，這表明黑豆相比于其他顏色大豆而言，是更好的花色苷與原花青素來源。而對于總黃酮含量來說，第四類大豆顯著高于第三類，且第三類和第四類大豆極顯著高于第一類和第二類大豆，這表明種皮色越深，總黃酮含量越高。從類胡蘿卜素含量看，第二類大豆顯著低于其余三類，但沒有達到極顯著水平，這表明相對于黑豆與棕褐色豆而言，黃豆與綠豆種皮的類胡蘿卜素含量更低。第一類大豆的葉綠素含量顯著高于其他三類，但只與第二類達到極顯著差異，第一類大豆除JP372外均帶綠色，這表明在大多綠色種皮大豆中葉綠素含量要高于其他顏色種皮大豆，但也有極少數(shù)綠豆葉綠素含量極低。

表5 不同類型大豆色素含量的特征分析

3 結(jié)論與討論

顏色是遺傳研究中最早的評估特性之一，起源于孟德爾所進行的工作。20世紀初，孟德爾的遺傳定律被世人所公認，此后在大豆中進行的遺傳研究大多與顏色特征相關。大豆種皮色在從野生大豆到栽培大豆的演變過程中逐漸從黑色變成黃色，是重要的形態(tài)標記，因此，大豆種皮色素的研究無論是對進化理論研究還是種子育種實踐都具有非常重要的意義。目前，世界各地關于大豆色素的研究有很多，但大多只研究了其中1種或2種[13-15]。大豆種皮色彩豐富，這些色彩的呈現(xiàn)可能包含其他色素，因此，對種皮色素的研究還需更加全面。本研究在前人研究的基礎上，分析不同顏色種皮的5種色素含量及相關關系，能夠為大豆種皮色素的發(fā)掘提供一定的參考。

色素含量雖與遺傳有關，其遺傳機理尚需進一步研究。但本研究表明，在大豆育種中，進一步加強對種皮色素含量的選擇是有效的。不同顏色的大豆其色素含量差異十分顯著，以花色苷、原花青素和總黃酮最為明顯，主要集中在黑豆及棕褐色豆這些顏色較深的品種，淺色種皮中含量較少，表明這三類色素可能是在大豆的馴化過程中，其表皮由深到淺的變化過程中流失的。在16個大豆品種中，均檢測到有葉綠素，而在大豆籽粒形成到成熟過程中，種皮由綠轉(zhuǎn)變?yōu)楦髯员旧淼念伾?，這表明在大豆成長發(fā)育過程中，葉綠素一直存在于大豆種皮中，但不同時期含量的變化還需進一步研究。各品種均檢測出類胡蘿卜素，而種皮類胡蘿卜素能保護其種子中的不飽和脂肪酸，為下一代的繁衍儲備能量，這與YUKI等[16]的分析結(jié)果一致。大豆種皮光澤度低，使大豆表皮呈現(xiàn)出啞光，這尤其以黑豆最為明顯，使得其表皮大多形成泥膜。本次研究發(fā)現(xiàn)，無論何種顏色大豆，其各類色素含量均與亮度呈反比，孫奇澤等[17]在研究彩色花生種皮色素時得出一致的結(jié)果。

有研究表明，種皮顏色與色素含量有顯著相關性。羅體英等[18]研究發(fā)現(xiàn)，黃籽油菜種子中與種皮顏色有顯著相關性的色素是花色苷。而郝志等[19]研究表明，彩色小麥中色素含量最高的是藍紫色小麥，而白色小麥色素含量最少。本研究結(jié)果表明，與種皮顏色有關的種皮色素為花色苷、原花青素、總黃酮、葉綠素和類胡蘿卜素。種皮顏色越深，種皮色素含量越高。這與DJORDJE等[20]的研究結(jié)果一致，色素含量測定較繁瑣，根據(jù)種皮顏色與色素含量的相關性，對大豆種皮色合理劃分等級，為今后按顏色篩選不同色素種子提供了依據(jù)。

由于大豆產(chǎn)品的廣泛使用，以大豆種皮色素為基礎的營養(yǎng)補充劑由于含有大量的天然抗氧化活性物質(zhì)，可用于功能性食品或制藥原料。本研究表明，與普通大豆（即黃、綠種皮大豆）相比，黑色和棕色種子的品種可能是更好的天然抗氧化劑來源。