郭 昱 ，李 娜 ，李 珊 ，韓淵懷 ，，段 明 ，馬芳芳 ，

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程研究所，山西太谷030801）

谷子（Setaria italica）為一年生草本植物，屬于禾本科狗尾草屬，大約公元前6 000 a，谷子從狗尾草馴化而來(lái)，成為我國(guó)北方主要的谷類作物[1]。谷子具有抗旱、耐貧瘠的特點(diǎn)，在炎熱和干燥的月份，僅需要少量的水就可以快速成熟，對(duì)不利農(nóng)業(yè)生態(tài)條件具有很強(qiáng)的適應(yīng)性。谷子是生活在干旱、半干旱地區(qū)的貧困農(nóng)民不可或缺的植物遺傳資源，廣泛分布于亞洲、北非和美洲其他地區(qū)的干旱和半干旱地區(qū)。自谷子參考基因組于2012年公布后，促進(jìn)了谷子各結(jié)構(gòu)特征、進(jìn)化基因組學(xué)和生理特性的研究和谷子基因、基因組和功能資源的開(kāi)發(fā)[2]。谷子基因組小（1 c～515 mb，2n＝2x＝18）、DNA重復(fù)序列少、近交性和短生命周期（一些種質(zhì)42 d），是一種新型的模式研究植物[3]。

OFP（OVATE familyprotein）蛋白家族是一類調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的特異性轉(zhuǎn)錄因子[4]，Ovate基因首先在番茄中被克隆，其C末端具有約70個(gè)氨基酸的結(jié)構(gòu)域，被命名為OVATE結(jié)構(gòu)域，并且在番茄、擬南芥和水稻中保守[5-6]。在擬南芥中，有18個(gè)OFP基因，其中，AtOFP1具有抑制植物細(xì)胞伸長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄活性因子的作用，過(guò)量表達(dá)AtOFP1的擬南芥植株表現(xiàn)出異常的形態(tài)學(xué)表型，因?yàn)锳tOFP1抑制了赤霉素（GA）生物合成酶基因AtGA20ox1的表達(dá)[7]。AtOFP4可以通過(guò)與各種KNAT和BLH蛋白物理相互作用，形成TALE-OFP蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)擬南芥束間纖維中的次生細(xì)胞壁形成[8]。由AtOFP5介導(dǎo)的BELL-KON XTALE蛋白復(fù)合體的異位活性抑制，對(duì)于擬南芥胚囊的正常發(fā)育和細(xì)胞形態(tài)的確定非常重要[9]。在水稻中，OsOFP2的過(guò)度表達(dá)改變了葉片形態(tài)和種子形狀，并通過(guò)下調(diào)OsGA20ox7的表達(dá)來(lái)抑制赤霉素的水平。OsOFP8通過(guò)油菜素內(nèi)酯信號(hào)通路調(diào)節(jié)水稻葉片傾斜，在該信號(hào)通路中，OsOFP8與OsGSK2相互作用并被OsGSK2磷酸化[10]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，OFP基因家族除了調(diào)控植物的生長(zhǎng)和發(fā)育外，其成員還參與了植物的逆境響應(yīng)調(diào)節(jié)。在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中，經(jīng)常受到干旱等各種環(huán)境壓力的影響，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育不利。許多植物基因已被證明在應(yīng)對(duì)非生物脅迫中起著重要作用，前人研究發(fā)現(xiàn)，NAC、MYB等蛋白參與一種或多種抵抗非生物脅迫機(jī)制[11-12]。MA等[13]研究發(fā)現(xiàn)，OsOFP6不僅調(diào)控水稻的生長(zhǎng)發(fā)育，而且調(diào)節(jié)植株對(duì)干旱和寒冷的響應(yīng)。OsOFP6在水稻中的過(guò)度表達(dá)可增強(qiáng)抗旱性和抗寒性，而抑制表達(dá)會(huì)導(dǎo)致超敏反應(yīng)，其在決定植物高度、粒徑、側(cè)根發(fā)育以及對(duì)非生物脅迫的反應(yīng)中起著重要作用。

干旱是制約作物生產(chǎn)力和影響世界生態(tài)系統(tǒng)的主要因素。據(jù)預(yù)測(cè)，全球氣候變化導(dǎo)致的長(zhǎng)期和更嚴(yán)重的干旱事件將加劇其對(duì)農(nóng)作物的負(fù)面影響，并危及全球糧食安全[14]。植物抗旱機(jī)制的研究、抗旱基因的挖掘、抗旱品種的培育，將有利于緩解由干旱造成的作物產(chǎn)量下降的危機(jī)。OFP基因家族在擬南芥、水稻中研究較多，且已經(jīng)在水稻中發(fā)現(xiàn)OFP基因家族成員可調(diào)節(jié)植株對(duì)干旱的響應(yīng)[13]。而OFP基因家族在抗旱性較強(qiáng)的谷子中的作用研究相對(duì)較少。

本研究結(jié)合谷子基因組信息，利用生物信息學(xué)方法，就谷子中所有OFP基因家族成員對(duì)蛋白理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、順式作用元件、染色體定位、進(jìn)化樹(shù)及其表達(dá)模式進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步研究該家族在谷子中的抗旱等功能，改良谷子的抗旱性提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試谷子品種為豫谷1號(hào)（YG）和安-04（AN），由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)雜糧育種團(tuán)隊(duì)提供。

1.2 方法

1.2.1 獲取基因組序列 從Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html） 下載谷子（Setaria italica v2.2）、擬南芥（Arabidopsis thaliana TAIR10）和水稻（Oryza sativav7_JGI）的基因組序列。

1.2.2 谷子OFP家族基因的篩選及基因定位 下載OFP的OVATE保守域蛋白序列（Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)編號(hào)PF04844）。通過(guò)HMMER中的hmmsearch命令對(duì)谷子的OFP基因數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)搜索[15]，設(shè)置比對(duì)值E值＜0.01。使用Pfam中的Batchsearch（http：//pfam.xfam.org/search#searchBatchBlock）對(duì)檢索到的蛋白序列結(jié)構(gòu)域進(jìn)行驗(yàn)證。使用TBtools[16]和谷子的基因組注釋gff3文件對(duì)基因定位結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.2.3 谷子OFP家族基因的理化性質(zhì)分析 利用ExPASY-ProtParam在線軟件（https：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)谷子OFP家族基因蛋白的氨基酸數(shù)目、等電點(diǎn)和分子量進(jìn)行分析。

1.2.4 谷子OFP家族基因的進(jìn)化分析 使用MEGA軟件[17]對(duì)OFP基因家族蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，采用MaximumLikelihood算法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，BootStrap參數(shù)設(shè)置為1 000，其他參數(shù)選擇默認(rèn)。

1.2.5 谷子OFP家族基因的基因結(jié)構(gòu)分析 在Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)中下載谷子OFP家族基因的CDS序列，結(jié)合谷子基因組序列，利用GSDS在線軟件（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）構(gòu)建 OFP 基因的結(jié)構(gòu)圖。

1.2.6 谷子OFP家族基因的保守基序及保守結(jié)構(gòu)域分析 谷子OFP家族的保守基序利用MEME進(jìn)行分析[18]，并使用TBtools對(duì)谷子OFP家族基因的motif進(jìn)行可視化。

1.2.7 谷子OFP家族基因啟動(dòng)子分析 將谷子OFP家族基因的啟動(dòng)子序列上傳至PlantCARE（http：//bio informatics.psb.gent.e/eboolslantcare/html）數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)谷子OFP家族基因進(jìn)行順式作用元件分析。

1.2.8 谷子OFP家族基因共線性分析及選擇壓力分析 為了解谷子OFP家族與擬南芥、水稻種間基因的共線性，用MCScanX[19]軟件對(duì)谷子OFP家族基因進(jìn)行共線性分析，使用TBtools可視化谷子OFP家族基因與擬南芥、水稻的種間共線性關(guān)系。利用Dna SP6[20]軟件對(duì)存在的共線性基因進(jìn)行Ka、Ks以及Ka/Ks分析，分析OFP家族基因在進(jìn)化過(guò)程中所受到的選擇壓力。

1.2.9 谷子OFP家族基因蛋白序列的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 通過(guò) PSORT Prediction（http：//psort1.hgc.jp/form.html）對(duì)谷子OFP家族基因的蛋白序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.2.10 谷子OFP家族基因的組織表達(dá)情況和干旱脅迫下的表達(dá)分析 谷子OFP基因在不同誘導(dǎo)下不同組織的表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)源于Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)，谷子OFP基因響應(yīng)干旱脅迫的表達(dá)數(shù)據(jù)來(lái)源于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物工程研究所實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。具體信息為：抗旱谷子品種豫谷1號(hào)和干旱敏感谷子品種安-04于光照培養(yǎng)室種植，出苗7 d后，保持土壤相對(duì)含水量在65%。14 d后處理組停止?jié)菜M(jìn)行自然干旱。干旱處理7 d后，大部分葉片出現(xiàn)萎蔫，分別于光照和黑暗時(shí)取樣，選取植株最新完全展開(kāi)葉片。利用FastQC[21-22]軟件對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，再利用Trimmonatic[23]軟件去除接頭、過(guò)濾低質(zhì)量的reads，得到clean data。利用Hisat2[24]軟件將clean data比對(duì)到谷子基因組中（Setaria italica v2.2），下載谷子基因組序列和注釋信息，采用StringTie[25]進(jìn)行表達(dá)水平定量，采用pheatmap包繪制表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子OFP家族基因的鑒定、理化性質(zhì)和基因定位

通過(guò)Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)分析后，篩選得到谷子OFP家族基因共34個(gè)；蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，谷子中 OFP蛋白的氨基酸序列長(zhǎng)度在198（Seita.5G128600）～542個(gè)（Seita.5G211000），平均序列長(zhǎng)度為304個(gè)，等電點(diǎn)在4.19（Seita.7G297300）～11.63（Seita.3G178000），不穩(wěn)定指數(shù)為 42.74～90.41，谷子OFP家族蛋白都屬于不穩(wěn)定蛋白，脂溶指數(shù)為52.29～73.10，總平均疏水指數(shù)為-0.83～-0.01（表1），說(shuō)明谷子中OFP蛋白都屬于親水性蛋白。基因定位可視化結(jié)果顯示（圖1），除了4號(hào)染色體不含有OFP基因外，其他8條染色體上均含有OFP基因，其中，5號(hào)染色體上分布的成員最多，有9個(gè)OFP基因，1、6號(hào)染色體上分布最少，均只有1個(gè)OFP基因。

表1 谷子OFP家族基因的序列特征

續(xù)表1

2.2 谷子OFP系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了進(jìn)一步明確不同物種間OFP基因的親緣進(jìn)化關(guān)系，基于谷子的34條OFP家族的蛋白序列和擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的18條OFP蛋白序列和水稻數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的6條水稻OFP蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，谷子中的OFP家族被分為三大亞類（圖2）。其中，第I類（紫色分支）中只有13個(gè)谷子OFP家族成員，表明這些基因在谷子中較擬南芥和水稻相對(duì)保守；第II類（綠色分支）中有8個(gè)谷子OFP家族成員與5個(gè)擬南芥OFP家族成員同源性較高；第III類（紅色分支）中有13個(gè)谷子OFP家族成員與7個(gè)擬南芥OFP家族成員和4個(gè)水稻OFP家族成員同源性較高。

2.3 谷子OFP基因家族的基因結(jié)構(gòu)分析

基因結(jié)構(gòu)分析顯示（圖3），34個(gè)谷子OFP基因可以分為三大類，僅基因Seita.7G115500和Seita.7G093000含有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，且編碼序列被內(nèi)含子分成2個(gè)部分，谷子OFP家族基因Seita.5G391700、Seita.3G130900、Seita.5G211000、Seita.9G245400、Seita.3G178000、Seita.3G205300、Seita.3G225700 只含有編碼序列。

2.4 谷子OFP家族基因保守基序及保守結(jié)構(gòu)域 分析

對(duì)谷子的OFP家族基因的蛋白序列進(jìn)行保守基序分析，分別命名為motif1～motif 8（圖4），結(jié)果表明，谷子中僅存在2個(gè)相對(duì)保守的基序motif1和motif2以及一個(gè)潛在的保守基序motif3。其中，10個(gè)OFP家族基因僅具有motif1和motif2，且保守基序排布順序均為motif1、motif2；在剩余的24個(gè)基因被鑒定到 motif 1、motif 2、motif 3，除了基因 Seita.5G307100中保守基序排布順序?yàn)閙otif 3、motif 1、motif2外，其余23個(gè)谷子基因中保守基序排布順序均為motif1、motif2、motif3。說(shuō)明OFP家族基因在谷子中比較保守。

2.5 谷子OFP家族基因啟動(dòng)子順式作用元件

提取谷子的OFP家族基因的啟動(dòng)子序列，進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖5），34個(gè)OFP家族基因共預(yù)測(cè)到14類順式作用元件。其中，34個(gè)基因都被預(yù)測(cè)到的順式作用元件與光響應(yīng)相關(guān)，僅基因Seita.2G432400預(yù)測(cè)到與調(diào)控類黃酮生物合成相關(guān)；激素類相關(guān)的順式作用元件預(yù)測(cè)到的有生長(zhǎng)素、赤霉素、脫落酸、茉莉酸和水楊酸，表明OFP家族在谷子中可能參與激素調(diào)控代謝途徑；谷子中的OFP家族基因預(yù)測(cè)到直接與脅迫相關(guān)的順式作用元件有低溫和干旱，表明OFP家族基因在谷子中可能直接參與寒冷和干旱2個(gè)非生物脅迫過(guò)程。

2.6 共線性分析及選擇壓力分析

對(duì)谷子OFP家族基因與擬南芥、水稻的種間共線性分析結(jié)果如圖6所示。

從圖6可以看出，谷子OFP家族基因中僅有5個(gè)基因與擬南芥5個(gè)基因存在共線性，其中，谷子 OFP家族基因 Seita.3G205300、Seita.5G363400和Seita.3G286300都與擬南芥的AT2G30400和AT5G01840存在共線性，表明這3個(gè)OFP家族基因在谷子中可能存在相似的功能；谷子與水稻共線性的基因數(shù)目較多，其中，34個(gè)OFP家族基因中有32個(gè)與水稻31個(gè)基因存在共線性，表明谷子OFP家族基因與水稻中的基因存在較近的親緣性，僅Seita.2G184300和Seita.5G128600這2個(gè)OFP基因在谷子中較保守，既不與水稻存在基因共線性也不與擬南芥存在基因共線性。

對(duì)共線性基因進(jìn)行選擇壓力分析可知（表2），谷子OFP家族基因與擬南芥的Ka/Ks值均小于1，表明谷子OFP家族基因在與擬南芥基因的進(jìn)化中可能受到了純化選擇作用；在與水稻共線性基因的Ka/Ks分析中，基因Seita.9G412200與水稻中的LOC_Os05g39950、LOC_Os07g48150以及基因Seita.8G037300與LOC_Os01g64430的Ka/Ks值均大于1，表明這2個(gè)谷子OFP基因在進(jìn)化選擇過(guò)程中受到正選擇作用。

表2 谷子OFP基因與水稻和擬南芥共線性基因的選擇壓力分析

2.7 谷子OFP家族基因亞細(xì)胞定位分析

對(duì)篩選到的34個(gè)谷子OFP家族基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示（圖7），預(yù)測(cè)定位到細(xì)胞核的基因數(shù)目最多，有18個(gè)基因被預(yù)測(cè)定位到了細(xì)胞核內(nèi)，僅1個(gè)基因（Seita.5G128600）被預(yù)測(cè)定位到了葉綠體基質(zhì)上，其余基因分別被定位到了細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體內(nèi)膜、線粒體基質(zhì)和質(zhì)膜上。

2.8 谷子OFP家族基因的表達(dá)模式分析

從Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)下載谷子OFP家族基因在各組織的表達(dá)量，將其制作成熱圖（圖8-A），結(jié)果顯示，谷子OFP家族基因在穗中表達(dá)量最多；藍(lán)光、遠(yuǎn)紅光誘導(dǎo)下的地上組織中表達(dá)量最少，基因Seita.9G245400、Seita.3G225700、Seita.5G233400 在紅光誘導(dǎo)下的地上組織中表達(dá)量最大，基因Seita.5G211000只在強(qiáng)光誘導(dǎo)下生長(zhǎng)2周的葉片中表達(dá)，基因Seita.3G130900只在強(qiáng)光誘導(dǎo)下生長(zhǎng)1周的谷子幼苗中表達(dá)，在其他誘導(dǎo)下幾乎不表達(dá)。

為了分析OFP家族基因在谷子干旱脅迫下的表達(dá)模式，利用谷子轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)OFP家族基因表達(dá)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示（圖8-B），干旱敏感品種安-04黑夜干旱處理組與黑夜對(duì)照組相比，OFP家族基因除了基因Seita.6G002800顯著上調(diào)外；大多顯著下調(diào)；白天干旱處理組與白天對(duì)照組相比，谷子OFP家族基因Seita.2G184300顯著下調(diào)，基因Seita.7G093000顯著上調(diào)，其他OFP家族基因在2組中表達(dá)量都很低；抗旱品種豫谷1號(hào)黑夜干旱處理組與黑夜對(duì)照組相比，OFP家族基因大多顯著下調(diào)，白天干旱處理組與白天對(duì)照組相比，除基因Seita.3G008900顯著上調(diào)外，其他基因大多表達(dá)下調(diào)或相似?？梢钥闯?，干旱敏感品種安-04和抗旱品種豫谷1號(hào)在黑夜干旱處理?xiàng)l件下于各自黑夜對(duì)照組相比，OFP家族基因大多表達(dá)下調(diào)。

3 結(jié)論與討論

Ovate基因最初被發(fā)現(xiàn)是控制番茄和茄子果實(shí)梨形發(fā)育的一個(gè)主要的數(shù)量性狀位點(diǎn)（QTL）[26]。LIU等[27]研究進(jìn)一步證實(shí)，Ovate基因的過(guò)表達(dá)使番茄梨形果表型恢復(fù)成圓形果表型，Ovate蛋白可以抑制果實(shí)頸部的生長(zhǎng)，是一類在植物發(fā)育中起著重要作用的負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白。之后，研究者在擬南芥和水稻中相繼發(fā)現(xiàn)，OFP家族基因廣泛地參與了調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程。除此之外，MA等[13]研究又發(fā)現(xiàn)，水稻中OsOFP6可以調(diào)節(jié)植株對(duì)干旱和寒冷的響應(yīng)，證實(shí)OFP家族基因還參與了植物的逆境響應(yīng)調(diào)節(jié)，關(guān)于OFP家族基因在谷子中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。所以，研究OFP家族基因在谷子中的特征和功能是非常有意義的。

本研究通過(guò)Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)分析篩選得到34個(gè)谷子OFP家族基因，基因定位顯示，3、5、9號(hào)染色體擁有OFP家族基因最多，分別為8、9、6個(gè)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，谷子OFP家族基因分成三大亞類，在進(jìn)化上I類OFP家族基因較擬南芥和水稻在谷子中保守，僅含有13個(gè)谷子OFP家族基因?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示，谷子OFP基因基本不含有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，僅基因Seita.7G115500和Seita.7G093000具有內(nèi)含子。谷子OFP家族基因蛋白序列均含有motif1和motif2這2種保守基序，且排布順序都為motif1在前，motif2在后，谷子OFP基因家族成員具有高度的保守性。OFP家族基因啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)到光響應(yīng)、類黃酮生物合成、激素調(diào)控代謝途徑、低溫和干旱等，其中，22個(gè)谷子OFP家族基因的啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測(cè)到與干旱誘導(dǎo)相關(guān)，表明谷子OFP家族基因可能參與谷子的干旱響應(yīng)調(diào)節(jié)。谷子與水稻共線性的基因數(shù)目較多，表明谷子OFP家族基因與水稻中的基因存在較近的親緣性。對(duì)共線性基因進(jìn)行選擇壓力分析表明，谷子OFP家族基因與擬南芥的Ka/Ks值均小于1，表明谷子OFP家族基因在與擬南芥基因的進(jìn)化中可能受到了純化選擇作用。亞細(xì)胞定位顯示，超過(guò)1/2的OFP家族基因定位在細(xì)胞核內(nèi)，符合轉(zhuǎn)錄因子的一般特征。

本研究還發(fā)現(xiàn)，谷子OFP基因在穗中表達(dá)量最多，在豫谷1號(hào)和安-04對(duì)照、處理各組中表達(dá)情況差異很大，表達(dá)具有時(shí)空特異性。豫谷1號(hào)干旱處理組與對(duì)照組相比以及安-04黑夜干旱處理組與黑夜對(duì)照組相比，OFP家族基因大多表現(xiàn)下調(diào)，這與蘋(píng)果中OFP家族基因表現(xiàn)一致[28]，可能是由于谷子在受到干旱脅迫時(shí)，作為調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子OFP家族基因感受到脅迫信號(hào)而表現(xiàn)下調(diào)，從而抑制下游控制植物生長(zhǎng)和發(fā)育的靶基因表達(dá)水平，使谷子植株生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制；安-04白天干旱處理組與白天對(duì)照組相比，只有OFP家族基因Seita.2G184300顯著下調(diào)，基因Seita.7G093000顯著上調(diào)，豫谷1號(hào)白天干旱處理組與白天對(duì)照組相比，只有基因Seita.3G008900顯著上調(diào)，這些基因的表達(dá)差異可能是造成豫谷1號(hào)和安-04抗旱性差異較大的原因之一，但仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究結(jié)果可為OFP基因家族在谷子中的功能研究提供基礎(chǔ)。