郭麗娜，趙慧婷，任有蛇，徐 兵，姜玉鎖

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，山西太谷030801）

中華蜜蜂（Apis cerana cerana）是我國特有的蜜蜂品種，它們善于利用零星蜜粉源，對(duì)山區(qū)和低溫開花植物授粉有著非常重要的作用，而中華蜜蜂的傳粉行為與其嗅覺系統(tǒng)中相關(guān)蛋白的功能有著密切的關(guān)系。其嗅覺感知的起始是由表達(dá)在嗅覺受體神經(jīng)元（ORNs）上的特異性的氣味受體識(shí)別周圍環(huán)境中的氣味分子并被激活，氣味分子與其同源的氣味受體Ors匹配激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，控制與氣味相關(guān)動(dòng)作電位產(chǎn)生的強(qiáng)度和時(shí)間。氣味受體的一個(gè)主要功能是對(duì)氣味的識(shí)別和編碼，氣味受體具有識(shí)別氣味分子并將胞外化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并從嗅覺感覺神經(jīng)元向大腦發(fā)送電信號(hào)，導(dǎo)致ORNs產(chǎn)生動(dòng)作電位。有關(guān)蜜蜂氣味受體的研究，最早是KRIGER等發(fā)現(xiàn)的意大利蜜蜂（Apis mellifera）AmelR2[1]，它與果蠅Or83b和岡比亞按蚊AgOr7同源，表達(dá)于觸角毛型感器和板形感器中。隨后從意大利蜜蜂基因組中鑒定出177個(gè)Ors[2]，東方蜜蜂（Apis cerana）全基因組測(cè)序鑒定出119個(gè)Ors[3]。與其他昆蟲相比，蜜蜂的氣味受體基因數(shù)量較多，這與蜜蜂和花之間的化學(xué)通訊及蜜蜂群體內(nèi)化學(xué)通訊存在著密切的關(guān)系[4]。

趙慧婷[5]在中華蜜蜂中克隆并鑒定出一個(gè)傳統(tǒng)的氣味受體 AcerOr1（GenBank 登錄號(hào)：JN544932），發(fā)現(xiàn)AcerOr1在工蜂和雄蜂不同發(fā)育階段的觸角中均有表達(dá)，表明AcerOr1可能參與了性別和分工嗅覺感知過程。但是中華蜜蜂AcerOr1基因的表達(dá)和分子機(jī)制尚不清楚，因此，本研究借助當(dāng)前基因組學(xué)及之前研究提供的數(shù)據(jù)，對(duì)中華蜜蜂AcerOr1基因的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)及其潛在的調(diào)控序列進(jìn)行了分析和推測(cè)，為深入研究AcerOr1在中華蜜蜂嗅覺中的功能提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

中華蜜蜂（Apis cerana cerana）采集于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)中蜂實(shí)驗(yàn)場(chǎng)。ExTaq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、pMD18－T Vector載體、T4 DNA Polymerase等均購自TaKaRa公司；DNA回收試劑盒購自Axygen公司，Genomic DNAIsolation Kit購自Biovision。

1.2 中華蜜蜂基因組DNA的提取

按照Genomic DNAIsolation Kit說明書提取。

1.3 特異性引物的設(shè)計(jì)及染色體步移擴(kuò)增

根據(jù)Genebank上中華蜜蜂（Apis cerana cerana）氣味受體（odorant receptors）AcerOr1基因cDNA序列（JN544932）分別設(shè)計(jì)引物 1、2（表 1），與 2 個(gè)接頭引物AP1、AP2形成巢式引物，進(jìn)行第1次步移擴(kuò)增。將得到的目的片段連接到pMD18－T載體上，送去測(cè)序。根據(jù)第1次擴(kuò)增的啟動(dòng)子序列，繼續(xù)設(shè)計(jì)引物3、4（表1），進(jìn)行第2次步移并測(cè)序。

表1 引物序列

1.4 目的片段回收、片段與載體連接、轉(zhuǎn)化及測(cè)序

根據(jù)電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，使用DNA膠回收試劑盒回收目的片段。將目的片段連接至pMD18－T Vector，并轉(zhuǎn)化E.coli進(jìn)行鑒定和篩選，將含有目的基因重組子的菌株送至華大基因進(jìn)行測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析

用DNAMAN等生物學(xué)軟件對(duì)序列進(jìn)行處理，然后將測(cè)序獲得的啟動(dòng)子序列提交至http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/、http：//www.cbrc.jp/research/d b/TFSEARCH.HTML進(jìn)行在線分析，預(yù)測(cè)啟動(dòng)子序列保守區(qū)域中潛在的順式作用元件。通過McPromote在線工具預(yù)測(cè)其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。用在線工具CpGIsland Searcher（http：//www.usenorris.com/cpgial ands2/cpg.aspx）預(yù)測(cè)中華蜜蜂AcerOr1基因是否含有CpG島以及CpG島位置。

2 結(jié)果與分析

2.1 AcerOr1啟動(dòng)子測(cè)序及分析

為了判斷該產(chǎn)物是否與AcerOr1基因相關(guān)，將獲得的1 831 bp序列登錄NCBI并BLASTn分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該序列的3′端與已有的中華蜜蜂AcerOr1基因序列的5′端部分同源率達(dá)到92%，而1 673 bp的5′端序列部分在GenBank數(shù)據(jù)庫中沒有同源片段（圖1），表明該片段是中華蜜蜂AcerOr1基因5′端的側(cè)翼序列。

用DNAMAN軟件將所克隆的中華蜜蜂AcerOr1啟動(dòng)子進(jìn)行分析。由圖1可知，目的片段1 831 bp，去除158 bp重疊序列后，剩余1 673 bp為中華蜜蜂AcerOr1基因啟動(dòng)子區(qū)域序列，該序列中堿基A比例為34.2%，堿基T比例為33.7%，堿基C比例為16.7%，堿基G比例為15.4%，AT含量較高，占67.9%；GC含量占32.1%，相差35.8百分點(diǎn)（表2）。通過CpG Island Searcher工具預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的中華蜜蜂AcerOr1基因5'側(cè)翼調(diào)控區(qū)域沒有符合條件的CpG島，對(duì)獲得的AcerOr1基因啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)預(yù)測(cè)，在1100～1139bp處存在基礎(chǔ)啟動(dòng)子，其序列為：5′-ATTATATAAATATTGCTCGTGGCAA AATGATTCATAAGT-3′。通過McPromote預(yù)測(cè)中華蜜蜂AcerOr1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)可能位于翻譯起始位點(diǎn)ATG上游621 bp處的堿基T，將此位點(diǎn)標(biāo)記為＋1，其可能性為0.98（圖2）。

表2 中華蜜蜂AcerOr1基因啟動(dòng)子區(qū)域堿基組成

2.2 AcerOr1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子分析

表3 作用元件種類及功能

在上游正鏈、下游負(fù)鏈不同的位置上分別有3個(gè)TATA-Box和 10個(gè)CAAT-Box，3個(gè)TATA-Box分別位于上游-292、-880 bp處，下游182 bp。應(yīng)用在線轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)程序（Http：//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.HTML）進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)，AcerOr1基因啟動(dòng)子序列中含有眾多其他元件，如與環(huán)境應(yīng)激相關(guān)的元件熱激蛋白因子HSF（AGAAA）；與胚胎發(fā)育或組織發(fā)育相關(guān)的元件：細(xì)胞因子CF2-II（TATATATA）、氮調(diào)控基因NIT2（TATCAA）、轉(zhuǎn)錄激活因子CdxA（ATTTATA）。通過這些作用元件，可以初步認(rèn)為克隆得到的DNA片段為具有調(diào)控功能的啟動(dòng)子序列（圖2、表3）。

3 結(jié)論與討論

本研究克隆到的中華蜜蜂組織特異性AcerOr1基因啟動(dòng)子大小為1 673 bp，片段內(nèi)AT堿基含量較高，占67.9%。真核生物的啟動(dòng)子相對(duì)復(fù)雜，位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游區(qū)域，在其指導(dǎo)下RNA聚合酶全酶和模板可以正確的結(jié)合并被活化，從而使基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。典型的真核生物啟動(dòng)子主要包括起始密碼子、TATA框、GC框、CAAT框等，其中，起始密碼子和TATA框又稱為核心啟動(dòng)子，是RNA聚合酶II重要的識(shí)別位點(diǎn)，能夠使酶準(zhǔn)確地識(shí)別轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并開始轉(zhuǎn)錄，保證轉(zhuǎn)錄得以精確起始[10]，對(duì)轉(zhuǎn)錄的起始具有重要的作用。本試驗(yàn)獲得的中華蜜蜂AcerOr1基因啟動(dòng)子TATA-Box分別位于上游-292、-880 bp處，下游182 bp，符合真核生物5′-TATA[A/T]A[A/T]-3′模式[11]。CAAT-Box與 TATA-Box同樣是真核基因啟動(dòng)子上游調(diào)控元件，控制著轉(zhuǎn)錄的起始頻率。本試驗(yàn)10個(gè)CAAT-Box表明該序列可能具有較高的啟動(dòng)頻率，但是大部分距離轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)較遠(yuǎn)，能否增強(qiáng)AcerOr1基因的轉(zhuǎn)錄效率還有待進(jìn)一步研究。

生物信息學(xué)分析在基因5′端調(diào)控區(qū)轉(zhuǎn)錄子和啟動(dòng)子分析中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用[12]。本研究利用啟動(dòng)子在線分析軟件，研究了中華蜜蜂氣味受體AcerOr1基因5′側(cè)翼區(qū)的各種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括與環(huán)境應(yīng)激相關(guān)的元件熱激蛋白因子HSF（AGAAA）；與胚胎發(fā)育或組織發(fā)育相關(guān)的元件：細(xì)胞因子 CF2-II（TATATATA）[6]、氮調(diào)控基因 NIT2（TATCAA）、轉(zhuǎn)錄激活因子CdxA（ATTTATA）。由以上預(yù)測(cè)出的與胚胎發(fā)育或組織發(fā)育和環(huán)境應(yīng)激相關(guān)的順式作用元件，推測(cè)可能是一個(gè)與生長發(fā)育和逆境脅迫有關(guān)的啟動(dòng)子。蜜蜂和其他的昆蟲一樣，屬于變溫動(dòng)物，環(huán)境溫度能直接影響其體溫的高低變化和生命過程。sHSPs是昆蟲抵御低溫?fù)p傷的成員之一，研究發(fā)現(xiàn)sHSPs基因的表達(dá)能提高果蠅在低溫環(huán)境下的生存率[13]。sHSPs在夜蛾Spodoptera litura和美洲斑潛蠅Liriomyza sativae滯育期表達(dá)升高，證明sHSPs與抗低溫脅迫有關(guān)[14]。sHSPs除了作為分子伴侶保護(hù)昆蟲在極端低溫、氧化、紫外線等不利環(huán)境條件下免受組織細(xì)胞損傷，還可以參與穩(wěn)定細(xì)胞骨架、保護(hù)細(xì)胞膜完整性、重組細(xì)胞核、抑制細(xì)胞凋亡及參與生物體的生長、發(fā)育和衰老過程。而熱激蛋白基因的表達(dá)受蛋白因子HSF的調(diào)節(jié)。中華蜜蜂嗅覺敏銳，抗寒耐熱，善于利用零星蜜粉源，其作為特殊的特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，近年來備受人們關(guān)注。

通過本試驗(yàn)可以初步認(rèn)為，中華蜜蜂AcerOr1基因的 5′側(cè)翼序列是一個(gè)具有 TATA-Box、CAAT-Box的典型真核生物啟動(dòng)子，有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，通過CAAT-Box控制轉(zhuǎn)錄起始頻率。AcerOr1基因啟動(dòng)子序列中還含有眾多其他元件，如與環(huán)境應(yīng)激相關(guān)的元件熱激蛋白因子HSF（AGAAA）；與胚胎發(fā)育或組織發(fā)育相關(guān)的元件：細(xì)胞因子 CF2-II（TATATATA）、氮調(diào)控基因 NIT2（TATCAA）、轉(zhuǎn)錄激活因子 CdxA（ATTTATA），表明AcerOr1基因在中華蜜蜂體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)可能受到胚胎、組織及外界環(huán)境的調(diào)控。該啟動(dòng)子的獲得，為下一步通過轉(zhuǎn)基因鑒定啟動(dòng)子活性及各種調(diào)控元件的作用奠定了基礎(chǔ)。