才 多，周云霞，何志玲，岳 萍

(1.西藏自治區(qū)藏醫(yī)院，西藏 拉薩 850000；2.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061001；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300072)

缺血性腦卒中(Cerebral ischemic stroke)是對腦供血動脈狹窄或閉塞、腦供血不足所導(dǎo)致腦組織壞死的總稱。當(dāng)前腦卒中是我國成年人致死、致殘的首位病因[1]，其中2016年我國缺血性腦卒中發(fā)病率為276.75/10萬，患病率為1762.77/10萬[2]，且具有高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率等特點。卒中后認(rèn)知功能障礙是嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及生存時間的重要因素，給患者、家庭、社會均帶來沉重負(fù)擔(dān)。研究表明，卒中后認(rèn)知功能障礙與患者偏癱呈顯著正相關(guān)，且認(rèn)知功能障礙較重的急性卒中患者偏癱程度較重[3]。在藏醫(yī)臨床實踐中，各地藏醫(yī)院普遍將藏醫(yī)藥浴療法用于治療缺血性卒中偏癱，并取得了顯著療效[4]，但對于認(rèn)知功能的改善情況則缺乏有效研究。本研究采用藏醫(yī)藥浴基礎(chǔ)方“五味甘露方”制取藥液，對MCAO大鼠模型進行浸浴治療，旨在探索傳統(tǒng)藏醫(yī)藥浴療法對缺血腦卒中大鼠記憶功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠30只,體重(200±20)g，日齡(40±5)d，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥液制備

選擇藏麻黃、水柏枝、大籽蒿、圓柏、黃花杜鵑(由西藏自治區(qū)藏醫(yī)院提供)5種藏藥材，按照臨床常用比例混合，打粉，采用兩種方法制備五味甘露藥液。煎煮法：將原藥材各取50 g置于藥鍋中，加水沒過藥材，浸泡12 h后直接煎煮；發(fā)酵法：取500 g青稞置于容器中，加入等比例的水浸泡24 h，煎煮至青稞開花后加入原藥材各50 g，煮沸，待冷卻至室溫后加入酒曲進行發(fā)酵，為期2 d，加入藥量3倍的涼水使藥液浸出，3 h后倒出藥液，繼續(xù)加入涼水使藥液浸出，重復(fù)3次，將3次所得藥液混合。

1.3 實驗藥品及試劑

Trizol(批號：15596-026，Invitrogen公司)，氯仿、異丙醇、無水乙醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)，DEPC水(北京索萊寶科技有限公司)，TIANScript RT KIT、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(批號：KR104-02、FP205，天根生物科技有限公司)。

1.4 實驗儀器

Morris水迷宮、渦旋振蕩儀(儀器型號：QL-902，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，離心機(儀器型號：Centrifuge 5415D，Eppendorf公司)，生物分光光度計(儀器型號：BioPhotometer，Eppendorf公司)，熒光定量PCR儀(儀器型號：Connect CFXTM，BIO-RAD公司)。

1.5 大鼠模型制備

參照Longa線栓法建立右側(cè)大腦中動脈栓塞模型：將大鼠腹腔注射麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺，頸部皮膚正中切口，暴露皮下組織和肌肉、右側(cè)頸總動脈，分離右側(cè)頸外動脈和頸內(nèi)動脈，微動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈。用眼科剪剪開頸總動脈約1 mm，用0.28 mm 標(biāo)準(zhǔn)魚線前端浸蠟0.5 mm后，插入頸內(nèi)外動脈約(17±0.5)mm處，感覺有阻力后停止(即達到較細(xì)大腦前動脈同時閉塞大腦中動脈)，剪去多余線體，逐層縫合皮膚。根據(jù)longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)進行神經(jīng)功能評定，將神經(jīng)功能評分達2分～5分者納入實驗。

1.6 干預(yù)方法

將模型大鼠隨機分為模型組、發(fā)酵優(yōu)選組、煎煮優(yōu)選組、熱水組，各組水池中加入定量浴液，每天分別對四組大鼠施加浸浴干預(yù)。水池中心設(shè)置一未露出水面的木樁以備大鼠抓握，讓其自由游泳或在水浴浸浴，盡量使其頭部以下全身浸泡于液體。每天20 min，連續(xù)15 d，15 d干預(yù)過程結(jié)束后對各項指標(biāo)進行觀察比較。實驗前對大鼠完成水迷宮練習(xí)，練習(xí)5 d，每天2次。

1.7 檢測方法

1.7.1 神經(jīng)行為學(xué)評分

分別于造模24 h、7 d、14 d進行神經(jīng)行為學(xué)評分。0分：無神經(jīng)功能缺失；1分：不能完全伸直左前肢；2分：行走時斷續(xù)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向左側(cè)持續(xù)轉(zhuǎn)圈；4分：向左側(cè)傾倒；5分：不能自動行走和意識水平下降。分?jǐn)?shù)越高,動物行為障礙越嚴(yán)重。

1.7.2 水迷宮試驗檢測

試驗共分為A、B、C、D 4個象限。大鼠訓(xùn)練前加自來水于水迷宮中，將平臺置于D象限水面下2 cm左右，使其可于實驗光線下對大鼠不可見。試驗均于9：00～15：00進行，需保持室內(nèi)安靜，燈光狀態(tài)及物品放置一致，水溫(23±2)℃。第1天～4天對大鼠進行定位航行：從2個象限按照逆時針方向?qū)⒋笫竺嫦虺乇诜庞谒?觀察且計時60 s。采用攝像系統(tǒng)記錄大鼠尋找且爬上平臺的時間為逃避潛伏期,若大鼠60 s內(nèi)未找到平臺,則引導(dǎo)其至平臺,讓其停留15 s,逃避潛伏期計為60 s，記錄實驗動物第一次上臺前總的行路程，稱為總路程，完成后以4 d的逃避潛伏期反映大鼠的學(xué)習(xí)能力。第5天進行空間探索實驗：將平臺撤除,從距原平臺最遠(yuǎn)的B象限將大鼠面向池壁放入水中,記錄大鼠在60 s內(nèi)各象限游泳時間，空間探索時間以在原平臺所在D象限游泳時間,作為記憶成績，計算跨平臺次數(shù)。

1.7.3 熒光定量PCR檢測

采用Realtime PCR法對大鼠海馬BDNF mRNA和VEGF mRNA基因表達進行測定，以NADPH為參照，每組取3例，每例重復(fù)檢測1次。應(yīng)用Exicycler Analysia程序生成數(shù)據(jù)進行分析，得到基因表達的相對定量結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)改變

24 h、7 d、14 d時間節(jié)點分別檢測各組神經(jīng)功能評分，結(jié)果顯示：7 d和14 d發(fā)酵組的大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分均明顯小于模型組(P<0.05)，動物行為障礙減輕。14 d時發(fā)酵組的大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分均明顯小于熱水組(P<0.05)，動物行為障礙減輕(見表1)。

表1 “五味甘露”藥液對缺血腦卒中大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分的影響

時間模型組熱水組煎煮組發(fā)酵組24h3.800±0.843.80±0.843.60±0.543.80±0.847d4.00±0.003.67±0.583.33±0.583.00±0.001)14d4.67±0.584.33±0.584.00±1.003.00±0.001)2)注:1)與發(fā)酵組比較,P<0.05;2)與熱水組比較,P<0.05。

7 d、14 d各組進行水迷宮試驗，潛伏期結(jié)果顯示：煎煮組、發(fā)酵組大鼠的潛伏期短于模型組(P<0.05)。煎煮組和發(fā)酵組大鼠潛伏期明顯短于熱水組(P<0.05)。14 d發(fā)酵組大鼠的潛伏期明顯短于煎煮組(P<0.05)。見表2。

總路程結(jié)果顯示：與模型組相比，發(fā)酵組大鼠的總路程明顯縮短(P<0.05)。與熱水組比較，發(fā)酵組大鼠總路程明顯縮短(P<0.05)。見表3。

穿越站臺次數(shù)結(jié)果顯示：與模型組相比，7 d時未發(fā)酵組和發(fā)酵組、14 d發(fā)酵組的大鼠穿越站臺次數(shù)均明顯增加(P<0.05)。與熱水組相比，7 d時未發(fā)酵組和發(fā)酵組、14 d發(fā)酵組的大鼠穿越站臺次數(shù)均明顯增加(P<0.05)。發(fā)酵組與未發(fā)酵組相比大鼠穿越站臺次數(shù)均明顯增加(P<0.05)。見表4。

表2 “五味甘露”藥液對缺血腦卒中大鼠水迷宮試驗潛伏期的影響

時間模型組熱水組煎煮組發(fā)酵組7d28.68±1.4526.07±3.3819.94±2.431)13.72±0.851)2)14d29.04±1.6626.08±3.8519.06±1.551)2)12.22±1.261)2)3)注:1)與模型組比較,P<0.05;2)與熱水組比較,P<0.05;3)與煎煮組比較,P<0.05。

表3 “五味甘露”藥液對缺血腦卒中大鼠水迷宮試驗總路程的影響

時間模型組熱水組煎煮組發(fā)酵組7d607.13±146.03602.34±88.92466.19±33.24283.21±49.991)2)14d642.94±166.55627.73±112.28417.04±41.21236.35±45.041)2)注:1)與模型組比較,P<0.05;2)與熱水組比較,P<0.05。

表4 “五味甘露”藥液對缺血腦卒中大鼠水迷宮試驗穿越站臺次數(shù)的影響

時間模型組熱水組煎煮組發(fā)酵組7d0.83±0.290.83±0.291.67±0.291)2)3.67±0.581)2)3)14d1.17±0.291.00±0.501.50±0.874.33±0.291)2)3)注:1)與模型組比較,P<0.05;2)與熱水組比較,P<0.05;3)與未發(fā)酵比較,P<0.05。

2.2 分子生物學(xué)改變

模型組、發(fā)酵優(yōu)選組、煎煮組、熱水組大鼠進行海馬取材，提取RNA進行相關(guān)基因檢測。結(jié)果顯示：發(fā)酵組大鼠的BDNF表達高于模型組；熱水組、煎煮組、發(fā)酵組大鼠VEGF的表達均高于模型組(P<0.05)，且發(fā)酵組VEGF的表達高于熱水組(P<0.05)。見表5。

表5 “五味甘露”藥液對缺血腦卒中大鼠Pcr統(tǒng)計結(jié)果的影響

模型組熱水組煎煮組發(fā)酵組BDNF1.0167±0.215481.4867±0.41861.9800±0.5902.7533±0.769501)VEGF0.9133±0.075061.2533±0.075061)2.02±0.45311)2.5267±0.466081)2)注:1)與模型組比較,P<0.05;2)與熱水組比較,P<0.05。

3 討 論

缺血性腦卒中在藏醫(yī)中屬于神志病“薩志布病”的范疇。藏醫(yī)傳統(tǒng)理論認(rèn)為，薩志布病是由貪、嗔、癡所致，三邪引發(fā)三因之隆及七精之血紊亂，進而出現(xiàn)昏倒、知覺喪失、不語、口斜、軀癱等病癥。藏醫(yī)《四部醫(yī)典》將“薩志布”分為水薩志布、火薩志布，并在治療中采用“藥械食行”四大療法加以治療，積累了豐富的臨床經(jīng)驗[5]。藏藥浴作為外治療法中的緩治療法，在改善缺血性卒中的偏癱方面已顯示了積極效果，有報道認(rèn)為，藏藥浴治療偏癱總有效率可達95.24 %[4]。本實驗結(jié)果證實了藥液浸浴對大鼠認(rèn)知功能的改善程度明顯優(yōu)于對照組，體現(xiàn)了藏醫(yī)藥浴療法對缺血性卒中所致認(rèn)知功能障礙的改善客觀有效。

藏醫(yī)藥浴療法是藏醫(yī)傳統(tǒng)療法，其重要特色即以“五味甘露”為主方，以發(fā)酵為關(guān)鍵制備工藝。目前藏醫(yī)臨床中對“五味甘露”的組方具有廣泛共識，即采用圓柏枝、杜鵑花、水柏枝、藏麻黃、大籽蒿5種藏藥，按照一定比例合理配制，充分發(fā)揮各自藥性達到預(yù)期療效；發(fā)酵工藝是以五味甘露方為主劑、青稞為輔劑，經(jīng)浸泡、煮制、發(fā)酵等程序制取藥液，該工藝屬自然發(fā)酵，所需時間長，過程煩瑣[6]。因而近年又出現(xiàn)了直接煎煮或直接加入乙醇等改良的藥液制備方法，但發(fā)酵與非發(fā)酵兩類藥液的療效差異則未見報告。本實驗設(shè)置了發(fā)酵和直接煎煮兩組，并與對照組分別比較，結(jié)果顯示：發(fā)酵組能使神經(jīng)功能行為評分明顯減小、動物行為障礙減輕，并可縮短大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期和總路程，增加大鼠單位時間內(nèi)通過原平臺位置次數(shù)，證明發(fā)酵組療效優(yōu)于直接煎煮，肯定了發(fā)酵工藝對于藏藥浴臨床療效的重要性，提示在臨床中應(yīng)該對這種傳統(tǒng)發(fā)酵工藝加以認(rèn)真?zhèn)鞒泻屠谩?/p>

缺血性卒中所致認(rèn)知功能障礙，一般認(rèn)為與腦血管損傷及內(nèi)皮功能異常有關(guān)，尤其是皮層、丘腦、海馬的缺血性病變引起線粒體功能障礙、微循環(huán)障礙及脂質(zhì)過氧化等缺血缺氧性腦損害，進而危害海馬組織、降低大鼠學(xué)習(xí)記憶功能[7]。海馬是學(xué)習(xí)記憶形成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，且對缺血缺氧改變敏感。已有研究表明，藏藥浴能促進血液循環(huán),加強機體代謝，恢復(fù)已麻痹的血管運動神經(jīng),并促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)及血液循環(huán)系統(tǒng)功能[4]，推測了該療法對于改善腦血管功能、提高認(rèn)知功能的可能性。本研究證實“五味甘露”藥液浸浴能改善缺血性腦卒中大鼠的記憶功能障礙，可上調(diào)大鼠海馬組織中VEGF、BDNF的表達，為發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子直接參與認(rèn)知功能的發(fā)生發(fā)展、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子減輕海馬損害提供了進一步的依據(jù)。

本研究采用了分子生物學(xué)和行為學(xué)方法，選取兩種工藝制取的藏藥浴基礎(chǔ)方藥液，觀察了對大鼠認(rèn)知功能障礙的改善情況，明確了藏藥浴療法對缺血性卒中的有效性，進一步證實了傳統(tǒng)發(fā)酵工藝的優(yōu)勢，初步探索了藥液浸浴改善認(rèn)知障礙的生物學(xué)依據(jù)，為藏藥浴臨床研究和推廣提供了科學(xué)依據(jù)。結(jié)合另一項基于403例腦卒中患者的藏藥浴衛(wèi)生經(jīng)濟學(xué)評價所證實的成本優(yōu)勢[8]，本研究也同時展示了藏藥浴在低成本改善腦血管認(rèn)知障礙、降低血管性癡呆發(fā)生率方面具有廣闊的應(yīng)用前景。