陳柏君 王進進 陳宗翰

[摘要] 目的 探討蒼艾揮發(fā)油（CAVO）吸入給藥的安全性及其對被動吸煙小鼠上呼吸道保護作用的機制。 方法 共計60只SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，取20只采用隨機數(shù)字表法分為空白組及藥物組（CAVO 2%），每組10只，進行CAVO安全性評價。另40只按照隨機數(shù)字表法分為被動吸煙模型組（模型組），CAVO高（3%）、中（2%）、低（1%）劑量組，每組10只，進行CAVO上呼吸道保護作用研究。除空白組外，其余各組復制模型組小鼠。在自制煙熏室內點燃3支香煙，早晚各1次，共計20 d。CAVO高、中、低劑量組造模同時吸入給藥20 d，早晚各1次，每次持續(xù)時間30 min。于造模給藥第21天取小鼠唾液采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定小鼠唾液分泌型免疫球蛋白（SIgA）含量。摘眼球取血測小鼠的白細胞計數(shù)、中性粒細胞百分比。并取出咽后壁組織進行觀察。 結果 藥物組小鼠白細胞計數(shù)和中性粒細胞百分比、SIgA含量、眼部組織與空白組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。與空白組比較，模型組小鼠SIgA含量明顯降低，白細胞計數(shù)、中性粒細胞百分比明顯升高（P < 0.01），咽部組織病理切片病變程度積分升高（P < 0.01）。與模型組比較，CAVO高、中、低劑量組，SIgA含量升高，白細胞計數(shù)和中性粒細胞百分比降低（P < 0.01）;CAVO中、高劑量組咽部組織病理切片病變程度積分降低（P < 0.01）。 結論 CAVO吸入給藥可降低被動吸煙對上呼吸道的損傷，修復上呼吸道的黏膜屏障，保護小鼠的上呼吸道黏膜免疫功能，并對小鼠上呼吸道無刺激。

[關鍵詞] 蒼艾揮發(fā)油;被動吸煙;分泌型免疫球蛋白A;黏膜免疫;上呼吸道損傷

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）03（c）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the safety of Cangai Volatile Oil （CAVO） by inhaled administration and the protective effect. Methods A total of 60 SPF Kunming mice with half male and half female were selected， and 20 of them were randomly divided into blank group and drug group （CAVO 2%） by random number table method， with 10 mice in each group for study the safety evaluation of CAVO. The other 40 were divided into the passive smoking model group （mode group）， the CAVO high （3%）， medium （2%） and low （1%） dose groups according to the random number table method， with 10 mice in each group for the study of protective effect of CAVO on upper respiratory tract. The model group were replicated in all groups except the blank group. Light 3 cigarettes in the homemade smoke room， once in the morning and once in the evening， for 20 days in total. The high， medium and low dose CAVO groups were molded and inhaled for 20 days at the same time， once in the morning and once in the evening， each lasting for 30 min. Secretory immunoglo-bulin A （SIgA） content in saliva of mice was determined by enzyme-linked immunosorbent assay on the 21st day of model administration. White blood cell count and percentage of neutrophils in mice were measured by eyeball extraction. The tissue of posterior pharyngeal wall was taken out for observation. Results There was no statistically significant difference in the white blood cell count and percentage of neutrophils， content of SIgA and ocular tissues between the drug group and the blank group （P > 0.05）. Compared with the blank group， the content of SIgA in the model group was significantly decreased， and the white blood cell count and the percentage of neutrophils were significantly increased （P < 0.01）， and the score of lesion degree in the pathological sections of pharyngeal tissues was increased （P < 0.01）. Compared with the model group， the content of SIgA increased and the white blood cell count and percentage of neutrophils decreased in the CAVO high， medium and low dose groups （P < 0.01）. The score of lesion degree in pharyngeal histopathological sections decreased in CAVO medium and high dose groups （P < 0.01）. Conclusion CAVO inhalation administration can reduce the damage of the upper respiratory tract caused by passive smoking， repair the mucosal barrier of the upper respiratory tract， protect the mucosal immune function of the upper respiratory tract of mice， and has no stimulation to the upper respiratory tract of mice.

[Key words] Cangai Volatile Oil; Smoking model mice; Secretory immunoglobulin A; Mucosal immune

據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）調查研究顯示，目前世界上有13億煙民，我國吸煙人數(shù)就有3.5億之多，二手煙霧每年造成60萬例過早死亡[1]。吸煙及被動吸煙對人體的健康危害已引起人們普遍關注，尤其是對嬰幼兒健康的危害，他們的活動場所為主要家庭，吸入二手煙的機會較多更易形成被動吸煙。研究提示被動吸煙能降低上呼吸道的黏膜免疫功能，增加呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率[2]，影響兒童的健康成長，因此不能忽視。蒼艾揮發(fā)油（Cang ai volatile oil，CAVO）是熊磊教授防治上呼吸道感染的臨床效驗方，本研究擬通過觀察CAVO對被動吸煙小鼠上呼吸道黏膜的影響，探討CAVO對被動吸煙小鼠上呼吸道的保護作用機制，為相關研究提供新視角。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

60只清潔級（SPF）昆明種小鼠雌雄各半，體重（20±2）g，購自四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所，動物生產許可證號：SCXK（川）2008-16，SPF級使用環(huán)境由云南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，動物使用許可證號：SYXK（滇）K2008-0005，經云南中醫(yī)藥大學倫理委員會批準，飼養(yǎng)于學校動物實驗中心非屏障室，室溫18～22℃，自由飲食，光照明暗控制12 h/12 h，濕度50%～60%，實驗前分籠飼養(yǎng)24 h。

1.2 藥物與試劑

制備CAVO所需藥物購自云南中醫(yī)學院門診部，按照《中華人民共和國藥典》[3]2015版揮發(fā)油測定法2204甲法進行提取，用無水硫酸鈉去除其中水分得金黃色油狀液體，氣味芳香，密度<1 mg/mL，1 mL≈0.8 g，置于棕色瓶中，放入4℃的冰箱備用。實驗時用0.5%的吐溫-80溶液配制使用。小鼠唾液分泌型免疫球蛋白IgA（SIgA）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（德國Reci公司，批號：lr-00130 15）;硝酸毛果蕓香堿滴眼液（山東博士倫富潤達制藥有限公司，批號：9080503）。香煙購自紅塔煙草有限責任公司，煙氣煙堿量：1.2 mg，焦油量：13 mg，煙氣一氧化碳量：13 mg。

1.3 儀器與設備

自制煙熏室（自制密封玻璃箱70 cm×40 cm×40 cm，五面體，其下部有4個直徑1 cm的半圓形透氣小孔）;酶標儀（上海生化有限公司，MK3）;隔水培養(yǎng)箱（北京永光明設備有限公司，DHP-9052）;電香薰爐（廣州市鑫圓電子科技有限公司）;血常規(guī)分析儀（北京立邦有限公司，F(xiàn)C-717）。

1.4 方法

1.4.1 CAVO對正常小鼠上呼吸道的安全性評價? 分組及給藥：取20只SPF級昆明種小鼠雌雄各半，按照隨機數(shù)字表法分為兩組，空白組及藥物組（CAVO 2%），每組10只。用自制煙熏室將小鼠連同飼養(yǎng)籠、電香薰爐一起密閉在內，吸入給藥20 d。

1.4.2 CAVO對被動吸煙小鼠上呼吸道的保護作用研究? 分組給藥與模型復制[4]：取40只SPF級昆明種小鼠雌雄各半，按照隨機數(shù)字表法分為4組，每組10只：被動吸煙模型組（模型組），CAVO高（3%）、中（2%）、低（1%）劑量組?！?.4.1”中空白組仍作為空白組。除空白組外，其余各組復制被動吸煙模型小鼠。在自制煙熏室內點燃3支香煙，早晚各1次，共計20 d。藥物治療組造模同時給予CAVO高、中、低劑量吸入給藥20 d，早晚各1次，每次持續(xù)時間30 min，于造模給藥第21天取小鼠唾液，摘眼球取血并取出咽后壁組織，常溫下用10%甲醛固定備用。

1.4.3 指標檢測? SIgA含量：腹腔注射毛果蕓香堿滴眼液0.2 mL，3 min后開始收集唾液，在離心小管內，放入-18℃的冰箱中保存?zhèn)溆?。固相夾心法ELISA測定小鼠唾液SIgA含量。

眼底靜脈血常規(guī)：將血液收集在放有肝素的離心小管內，用血常規(guī)檢測儀測小鼠的白細胞計數(shù)、中性粒細胞百分比。

咽后壁組織切片：處死小鼠后，取咽部組織用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后在光學顯微鏡下觀察[5]上皮增生、上皮脫落、血管擴張充血、炎細胞浸潤、腺體分泌、腺體增生、腺體擴張、纖維增生情況，按程度積分。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗;不符合正態(tài)分布改用中位數(shù)（M）和四分位數(shù)（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗;以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CAVO對正常小鼠上呼吸道的安全性

2.1.1 免疫指標? 藥物組小鼠白細胞計數(shù)和中性粒細胞百分比、SIgA含量與空白組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.1.2 咽部組織切片? 光鏡下觀察空白組無黏膜上皮增生或脫落，也未見血管擴張充血及纖維組織增生;咽部各層均無炎性細胞浸潤，無腺體分泌異常、腺體增生及擴張現(xiàn)象。藥物組小鼠咽部組織黏膜上皮完整，無壞死脫落及增生現(xiàn)象，黏膜固有層及黏膜下層無血管擴張充血、炎性細胞浸潤及纖維組織增生現(xiàn)象，黏膜下層黏液腺之形態(tài)及分泌無異常。與空白組比較，藥物組的咽部組織無影響，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表2、圖1。

2.2 CAVO對被動吸煙小鼠上呼吸道的保護作用

2.2.1 免疫指標? 與空白組比較，模型組小鼠SIgA含量明顯降低，白細胞計數(shù)、中性粒細胞百分比明顯上升（P < 0.01）;與模型組比較，CAVO高、中、低劑量組，SIgA含量升高，白細胞計數(shù)和中性粒細胞百分比降低（P < 0.01）。見表3。

2.2.2 咽部組織病理切片? 與空白比較，模型組小鼠病變程度積分升高（P < 0.01）;與模型組比較，CAVO中、高劑量組病變程度積分降低（P < 0.01）。見表4。模型組血管明顯擴張充血，輕度腺體及腺上皮增生，大量炎細胞浸潤（圖4B～D）;CAVO低劑量腺體明顯擴張，血管輕度擴張、充血、炎細胞侵潤（圖4E～F）;CAVO中劑量組腺體輕度擴張，散在炎細胞侵（圖4G）;CAVO高劑量組腺體擴張不明顯，散在炎細胞侵潤（圖4H）。見圖2。

3 討論

上呼吸道的黏膜免疫是人體防御疾病的重要防線，SIgA是執(zhí)行局部黏膜免疫的主要抗體。被動吸煙能降低兒童上呼吸道的免疫功能[6-8]，增加呼吸道疾病的患病風險。兒童接觸環(huán)境中被動吸煙的強度與呼吸道感染率相關，特別是兒童與父母在同一房間的被動吸煙[9]。研究顯示，香煙煙霧在體外[10]和體內[11]都顯著降低了呼吸道上皮細胞的纖毛擺動，可損害小鼠鼻腔上皮細胞的纖毛生長[12]。香煙的煙霧也與黏液分泌密切相關，慢性接觸煙霧可導致呼吸道上皮化生的杯狀細胞的數(shù)量和大小增加，從而增加上呼吸道的黏液分泌[13]。煙霧還抑制鼻腔中上皮細胞白細胞介素（IL）-8和人β防御素-2（human β-defensin-2，HBD-2）的含量，提示香煙煙霧可能對鼻腔固有免疫具有抑制作用[14]。此外，煙草煙霧增加了呼吸道黏膜對各種病毒和細菌[15]的易感性，這可能導致反復的呼吸道感染。

本研究結果與文獻報道一致，被動吸煙后模型小鼠的上呼吸道黏膜免疫的屏障功能遭到破壞，咽后壁組織的黏膜上皮有輕至中度增生，固有層及黏膜下血管顯著擴張充血，炎細胞呈輕至重度浸潤，以淋巴、單核細胞為主，黏膜固有層有輕、中度纖維組織增生現(xiàn)象，黏膜下層內黏液腺呈中、重度擴張，腺體分泌活躍，腺腔內分泌物增多，腺上皮也有不同程度增生，腺腔狹窄，呈現(xiàn)出慢性組織病理改變;同時由于黏膜的屏障功能遭到破壞，導致局部SIgA合成障礙，向黏膜表面的轉運也受影響，因此檢測發(fā)現(xiàn)小鼠唾液SIgA含量明顯降低。

中醫(yī)有“芳香避穢”“聞氣治病”之說，“藥氣從口、鼻孔中直達肺，通經貫絡，透徹周身，卒病治疴，從癥用之，以助服藥之所不及”等記載?？诒窍嗤?，鼻下連及氣管和肺，藥物吸入后可直達上呼吸道而發(fā)揮治療作用的[16]。前期研究顯示，CAVO大鼠經鼻吸入給藥后，肺組織中含量最高[17]，對于防治呼吸道疾病有一定的優(yōu)勢。

CAVO系熊磊教授防治上呼吸道感染的臨床效驗方，選用蒼術、艾葉、藿香等含揮發(fā)油成分較多、氣味清香、抗菌力強的中藥為組方。方中蒼術、艾葉芳香化濕、避穢解毒為君;藿香芳香化濕、解表祛暑為臣，諸藥合用，共奏芳香化濁、避穢解毒之功。前期研究提示CAVO對金黃色葡萄球菌，甲型、乙型鏈球菌，肺炎鏈球菌等上呼吸道感染的常見菌株有明顯的抑菌作用[18]。經GC-MS檢測CAVO中的主要成分為1，8-桉葉素、廣藿香醇、β-石竹烯等，現(xiàn)代研究顯示，1，8-桉葉素[19]、廣藿香醇[20]、β-石竹烯[21]等具有較好的抗菌、抗炎、免疫調節(jié)作用。被動吸煙能造成小鼠上呼吸道黏膜慢性炎癥損傷，同時能降低SIgA的含量，這與以往文獻報道相符，CAVO吸入給藥對正常小鼠上呼吸道黏膜無刺激，可修復被動吸煙模型小鼠上呼吸道黏膜損傷，提高唾液SIgA的含量，由此推測，CAVO對被動吸煙小鼠上呼吸道的保護作用與修復上呼吸道黏膜的屏障功能，同時促進SIgA的合成分泌相關。

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（收稿日期：2019-07-11? 本文編輯：劉永巧）