李淑麗 陸善詞 王軍 楊海輝 何娟 梁連輝 高文軍

【摘要】 目的 探討檢測血清谷胱甘肽還原酶（GR）活性水平在乙型肝炎輔助診斷中的應用價值。方法 選取140例確診為乙型肝炎的患者作為陽性組， 另選取同期430例表觀健康者作為對照組， 檢測兩組研究對象的血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、GR以及總膽紅素（TBIL）水平。采用組間比較和分層比較評估GR活性水平與由乙型肝炎引起肝損傷的關聯(lián)性和診斷效能。結果 兩組研究對象的年齡、ALT、AST、TBIL、ALP和GR檢測結果均呈非正態(tài)分布。對照組研究對象年齡中位數(shù)為35.0歲， 略高于陽性組的33.0歲， 但兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;陽性組ALT、AST、TBIL、ALP、GR水平均顯著高于對照組， 差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。對ALT、AST、TBIL、ALP和GR進行受試者工作特征（ROC）曲線分析， 可知血清GR活性水平對乙肝患者肝損傷的診斷界值為61.5 U/L， 曲線下面積（AUC）為0.882[95%CI=（0.845， 0.919）， P<0.05]， 靈敏度為78.6%， 特異度為89.3%。對不同生物標志物的ROC曲線進行比較， ALT和AST的AUC最大， 但兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;GR的AUC次于ALT和AST， 但優(yōu)于TBIL和ALP， 比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;TBIL和ALP的AUC較差， 兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。將陽性組研究對象按GR活性水平四分位數(shù)間距（Q）進行分層：ALT和AST活性水平均隨GR活性水平的升高而升高（P<0.05）， 在Q1～Q2區(qū)間內升高較緩（P>0.05）， 在Q3～Q4區(qū)間內迅速升高（P<0.05）;TBIL和ALP在Q1～Q3區(qū)間內趨勢不顯著（P>0.05）， 僅有Q4與其他層級相比有顯著升高（P<0.05）;年齡未顯示出明顯的趨勢（P>0.05）。結論 血清GR活性水平升高與由乙型肝炎引起的肝損傷顯著相關， 檢測血清GR活性水平可作為輔助診斷、治療各類肝病、評估肝損傷程度的方法。

【關鍵詞】 谷胱甘肽還原酶;肝損傷;乙型肝炎

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.09.003

【Abstract】 Objective? ?To discuss the application value of serum glutathione reductase （GR） activity level in the auxiliary diagnosis of hepatitis B. Methods? ?There were 140 patients with hepatitis B selected as the positive group and concurrent 430 patients with apparent health as the control group. The levels of alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， alkaline phosphatase （ALP）， GR and total bilirubin （TBIL） of the two groups were detected. Inter-group comparison and stratified comparison were used to evaluate the correlation and diagnostic efficacy of GR activity level with liver injury caused by hepatitis B. Results? ?The age， ALT， AST， TBIL， ALP and GR test results of the two groups showed non-normal distribution. The median age of the control group was 35.0 years old， which was slightly higher than 33.0 years of the positive group， but there was no significant difference between the two groups （P>0.05）. The levels of ALT， AST， TBIL， ALP and GR in the positive group was significantly higher than those in the control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The receiver operator characteristic （ROC） curve analysis of ALT， AST， TBIL， ALP and GR showed that the diagnostic threshold of serum GR activity for liver injury in patients with hepatitis B was 61.5 U/L， area under the curve （AUC） was 0.882 [95%CI=（0.845， 0.919）， P<0.05]， sensitivity was 78.6%， and specificity was 89.3%. Comparing the ROC curves of different biomarkers， AUC of ALT and AST had the highest diagnostic efficacy， but there was no statistically significant difference between the two （P>0.05）. AUC of GR was inferior to ALT and AST， but it was better than TBIL and ALP， and the difference was statistically significant （P<0.05）. AUC of TBIL and ALP were worse， and the difference was not statistically significant （P>0.05）. The positive group were stratified according to the quartile interval （Q） of GR activity level： ALT and AST activity levels increased with the increase of GR activity level （P<0.05）， increased slowly in the interval of Q1-Q2 （P>0.05）， and increased rapidly in the interval of Q3-Q4 （P<0.05）. TBIL and ALP did not show significant trends in the Q1-Q3 interval （P>0.05）. Only at Q4 it showed a significant increase compared to other levels （P<0.05）， and age did not show a significant trend （P>0.05）. Conclusion? ?The increase of serum GR activity was significantly related to liver injury caused by hepatitis B. The detection of GR activity in serum can be used as an assistant method to diagnose， treat various liver diseases and evaluate the degree of liver injury.

【Key words】 Glutathione reductase; Liver injury; Hepatitis B

肝臟病變包括甲型肝炎（甲肝）、乙型肝炎、丙型肝炎（丙肝）、肝硬化、脂肪肝、肝癌、酒精肝等多種形式[1]， 是一種常見的危害性極大的疾病， 肝損傷是這類疾病的主要臨床表征之一[2]。谷胱甘肽是一種細胞內關鍵的抗氧化劑， 在代謝清除親電異源性物質的生理活動中起重要作用[3]。GR可催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）轉變成還原型谷胱甘肽（GSH）的還原反應， 保持有機體內GSH處于高水平， GSSG處于低水平， 維持體內適當還原態(tài)環(huán)境[4， 5]。Rall和Backer于上世紀50年代于肝臟內發(fā)現(xiàn)GSH和GR[6， 7]。在多種肝臟疾病中， 尤其是傳染性肝炎、急性肝炎的初始階段、肝硬化以及涉及肝臟轉移的惡性病變中， 患者血清中的GR活性水平均有顯著升高[8， 9]。此外， 在不同的臨床環(huán)境中， GR與其他肝源型的酶蛋白， 如轉氨酶和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）等在體內的水平有顯著差異。在最近的研究中， 在動物模型和臨床試驗中均證實， GSH對肝損傷有保護和修復作用[10， 11]， 因此， GR可作為肝損傷程度的評估指標， 檢測血清中的GR活性水平有助于輔助診斷、治療各類肝病、評估肝損傷程度、監(jiān)測治療效果， 為現(xiàn)有常規(guī)肝功能檢測指標提供補充。在肝炎的診療過程中， 往往只注重其傳染性， 缺少適宜的生物標志物對由疾病引起的肝損傷程度進行評估和跟蹤。本研究以臨床確診的乙型肝炎患者為肝損傷模型， 以自建檢測體系調查了血清GR活性水平在表觀健康人群與肝損傷個體中的分布水平， 及其與其他常規(guī)肝功能檢測項目的關聯(lián)性和差異性， 為臨床應用GR輔助診斷、治療各類肝病、評估肝損傷程度提供依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2018年3月～2019年4月在廣東省中山市第二人民醫(yī)院確診為乙型肝炎患者140例作為陽性組， 其中男107例， 女33例;年齡18～83歲。另選取同期該院體檢中心表觀健康者430例作為對照組， 其中男335例， 女95例;年齡18～83歲。兩組研究對象一般資料比較， 差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）， 具有可比性。

1. 2 納入標準 對照組納入標準：所有入選者年齡均≥18歲;肝功能檢測無異常， 結果處于正常參考區(qū)間內[丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase， ALT）：5～40 U/L;門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase， AST）：0～40 U/L;谷氨酰轉移酶（GGT）：0～55 U/L;總膽紅素（total bilirubin， TBIL）：1.7～26 μmol/L;ALP：40～150 U/L];乙型肝炎兩對半檢查結果中乙型肝炎表面抗原（HBSAg）為陰性;丙型肝炎病毒抗體（HCV-IgG）檢測結果為陰性。陽性組納入標準：所有入選者年齡均≥18歲;乙型肝炎兩對半檢查結果中乙型肝炎表面抗原為陽性， 乙型肝炎E抗原（HBeAg）為陽性， 且乙型肝炎核心抗體（HBcAb）為陽性。

1. 3 方法

1. 3. 1 樣本采集 所有研究對象空腹取靜脈血， 2 h內離心并分離血清， 在24 h內進行檢測的樣本可冷藏（2～8℃）保存;24 h內無法測定的樣本需冷凍保存（-20 ℃或以下）， 不能反復凍融， 冷凍保存的樣本最多保存6個月。血清樣本體積≥1 ml。

1. 3. 2 生化指標檢測 血清GR活性采用GSSG底物法檢測， 試劑盒由上海潤鴻生物科技有限公司提供， 檢測儀器為HITACHI 7180全自動生化分析儀（日本日立公司）。ALT、AST、TBIL和ALP試劑盒由上海執(zhí)誠生化科技有限公司提供， 檢測儀器為日立7180全自動生化分析儀（日本日立公司）或SIEMENS ADVIA1800全自動生化分析儀（德國西門子公司）。乙型肝炎兩對半采用cobas e411全自動電化學發(fā)光分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（電化學發(fā)光法）檢測。丙型肝炎采用酶聯(lián)免疫法檢測， 試劑盒購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司， 檢測儀器為BioTek ELX80酶標儀（美國寶特公司）。

1. 4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用Kolmogorov-Smirnov法進行正態(tài)性檢驗。正態(tài)分布資料采用均數(shù)±標準差 （ x-±s）表示， 兩組間比較采用t檢驗， 相關性分析采用Pearson相關分析， 多組間比較采用單因素方差分析。非正態(tài)分布資料采用M（P25， P75）表示， 兩組間比較采用Mann-Whitney檢驗， 相關性分析采用Spearman相關分析， 多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic， ROC）曲線確定GR活性水平對乙型肝炎患者的診斷界值。曲線下面積（area under curve， AUC）相互比較采用Delong法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2. 1 兩組各項生化指標測定結果比較 兩組研究對象的年齡、ALT、AST、TBIL、ALP和GR檢測結果均呈非正態(tài)分布。對照組研究對象年齡中位數(shù)為35.0歲， 略高于陽性組的33.0歲， 但比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;陽性組ALT、AST、TBIL、ALP、GR水平均顯著高于對照組， 差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1， 圖1。

2. 2 不同生物標志物AUC比較 對ALT、AST、TBIL、ALP和GR進行ROC曲線分析， 可知血清GR活性水平對乙型肝炎患者肝損傷的診斷界值為61.5 U/L，?AUC為0.882[95%CI=（0.845， 0.919）， P<0.05]， 靈敏度為78.6%， 特異度為89.3%。對不同生物標志物的ROC曲線進行比較， ALT和AST的AUC最大， 但兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;GR的AUC次于ALT和AST， 但優(yōu)于TBIL和ALP， 比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;TBIL和ALP的AUC較差， 兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

2. 3 不同GR活性水平的生物標志物水平比較 將陽性組研究對象按GR活性水平四分位數(shù)間距（Q）進行分層：ALT和AST活性水平均隨GR活性水平的升高而升高（P<0.05）， 在Q1～Q2區(qū)間內升高較緩（P>0.05）， 在Q3～Q4區(qū)間內迅速升高（P<0.05）;TBIL和ALP在Q1～Q3區(qū)間內趨勢不顯著（P>0.05）， 僅有Q4與其他層級相比有顯著升高（P<0.05）;年齡未顯示出明顯的趨勢（P>0.05）。見圖2， 表3。

3 討論

肝臟在有機體的代謝和排毒過程中起關鍵作用。藥物、內源性或異源性物質等多種因素都會引起氧化應激反應， 產(chǎn)生自由基， 導致肝損傷[12]。GSH在肝臟的親電物質轉運系統(tǒng)中起重要作用， 而谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase， GPx）和GR參與調節(jié)維持GSH微循環(huán)[13]， 清除自由基和過氧化物， 抵御各類疾病、內源性和外源性侵入[14]?，F(xiàn)有研究表明， 肝損傷患者血清和肝臟中的GR活性水平均顯著升高， 且早于血清ALP的活性上升， 其生理過程可能為：肝損傷時， 細胞膜的滲透能力發(fā)生變化， 導致GR隨ALT等其他肝源性酶一同從這些組織內釋放至血液中[9]。進一步研究確認， 肝損傷過程中的氧化應激反應導致了血清中GR活性水平的上升[12]。在由四氯化碳誘導的肝損傷動物模型中， 氧化應激反應促使細胞產(chǎn)生自由基， 損害肝臟;而機體自身的抗氧化保護系統(tǒng)被激活以消除自由基帶來的損傷， 在該系統(tǒng)中， GPx借助GSH傳遞電子消除有機物或無機過氧化物生成GSSG， 而GR則將GSSG還原為GSH循環(huán)利用[15]， 機體自身通過增加GPx和GR的活性水平改善體內的氧化還原環(huán)境， 從而消除有害環(huán)境的影響。

本課題組早前已報道， 在表觀健康人群中， 男性的血清GR活性水平顯著高于女性， 分別為39～72 U/L和41～65 U/L， 且血清GR活性水平升高與肝損傷顯著相關， 是由乙型肝炎引起的肝損傷的獨立危險因子[16]。本研究將GR活性水平檢測初步應用到臨床實踐中， 結果顯示， 兩組研究對象的年齡、ALT、AST、TBIL、ALP和GR檢測結果均呈非正態(tài)分布。對照組研究對象年齡中位數(shù)為35.0歲， 略高于陽性組的33.0歲， 但兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;陽性組ALT、AST、TBIL、ALP、GR水平均顯著高于對照組， 差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。對ALT、AST、TBIL、ALP和GR進行ROC曲線分析， 可知血清GR活性水平對乙肝患者肝損傷的診斷界值為61.5 U/L， AUC為0.882[95%CI=（0.845， 0.919）， P<0.05]， 靈敏度為78.6%， 特異度為89.3%。對不同生物標志物的ROC曲線進行比較， ALT和AST的AUC最大， 但兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;GR的AUC次于ALT和AST， 但優(yōu)于TBIL和ALP， 比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;TBIL和ALP的AUC較差， 兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。將陽性組研究對象按GR活性水平四分位數(shù)間距（Q）進行分層：ALT和AST活性水平均隨GR活性水平的升高而升高（P<0.05）， 在Q1～Q2區(qū)間內升高較緩（P>0.05）， 在Q3～Q4區(qū)間內迅速升高（P<0.05）;TBIL和ALP在Q1～Q3區(qū)間內趨勢不顯著（P>0.05）， 僅有Q4與其他層級相比有顯著升高（P<0.05）;年齡未顯示出明顯的趨勢（P>0.05）。一般認為， 當肝損傷時， 只要1%的肝細胞發(fā)生壞死， 血清ALT活性水平即急劇升高， 是最敏感的肝源性生物標志物。而本研究分層結果提示， 當肝損傷發(fā)生時， 血清GR活性水平升高可能更早于ALT和AST， 因為當GR活性水平變化顯著時， 血清ALT和AST活性水平尚未出現(xiàn)顯著性變化。而TBIL和ALP則相對更加滯后。該現(xiàn)象可能與這些活性酶的釋放機制有關：GR與ALT和AST一樣， 在肝損傷初期， 細胞膜通透性增強時， 自肝細胞釋放至血清中;而ALP經(jīng)膽管排泄， 肝損傷時， 肝細胞對其攝取發(fā)生功能異常， 從而使ALP在脂膜上滲析進入血液循環(huán)。

綜上所述， 在乙型肝炎病程中， 血清GR活性水平升高與肝損傷顯著相關， 相比傳統(tǒng)生物標志物ALT和AST， 在時效性上更具優(yōu)勢， 檢測血清GR活性水平可以作為輔助診斷、治療各類肝病、評估肝損傷程度的方法。但需要指出的是， 本研究僅采用了最具代表性的“大三陽”型乙型肝炎患者作為研究對象， 未考慮其他肝臟疾病類型， 需在后續(xù)研究中進一步驗證其臨床價值。

參考文獻

[1] Xiao J， Wang F， Wong N， et al. Global liver disease burdens and research trends： analysis from a Chinese perspective. J Hepatol， 2019（71）：212-221.

[2] Hou X， Ye F， LI X， et al. Immune response involved in liver damage and the activation of hepatic progenitor cells during liver tumorigenesis. Cell Immunol， 2018（326）：52-59.

[3] Deponte M. Glutathione catalysis and the reaction mechanisms of glutathione-dependent enzymes. BBA-Gen Subjects， 2013， 1830（5）：3217-3266.

[4] Couto N， Wood J， Barber J. The role of glutathione reductase and related enzymes on cellular redox homoeostasis network. Free Radical Bio Med， 2016（95）：27-42.

[5] Poprac P， Jomova K， Simunkova M， et al. Targeting free radicals in oxidative stress-related human diseases. Trends Pharmacol Sci， 2017， 38（7）：592-607.

[6] Rall TW， Lehninger AL. Glutathione reductase of animal tissues. J Bio Chem， 1952， 194（1）：119-130.

[7] Backer E. Glutathione reductase from baker's yeast and beef liver. J Bio Chem， 1955， 217（2）：855-866.

[8] Delides A， Spooner RJ， Goldberg DM， et al. Delides A， An optimized semi-automatic rate method for serum glutathione reductase activity and its application to patients with malignant disease. J Clin Pathol， 1976， 29（1）：73-77.

[9] Kumata H， Wakui k， Suzuki H， et al. Glutathione reductase activity in serum and liver tissue of human and rat with hepatic damage. Tohoku J Exp Med， 1975， 116（2）：127-132.

[10] Koruk M， Taysi S， Cemil Savas M， et al. Oxidative stress and enzymatic antioxidant status in patients with nonalcoholic steatohepatitis. Ann Clin Lab Sci， 2004， 34（1）：57-62.

[11] Iskusnykh IY， Popova TN， Agarkov AA， et al. Expression of glutathione peroxidase and glutathione reductase and level of free radical processes under toxic hepatitis in rats. J Toxicol， 2013（2013）：870628.

[12] Ivanov AV， Bartosch B， Smirnova OA， et al. HCV and oxidative stress in the liver. Viruses， 2013， 5（2）：439-469.

[13] Hopkins FG， Elliott KAC. The relation of glutathione to cell respiration with special reference to hepatic tissue. Proc R Soc B， 1932， 109（760）：58-88.

[14] Zhu Z， Du S， Du Y， et al. Glutathione reductase mediates drug resistance in glioblastoma cells by regulating redox homeostasis. J Neurochem， 2017， 144（1）：93-104.

[15] Pashkov AN， Popov SS， Semenikhina AV， et al. Glutathione system state and activity of some NADPH-producing enzymes in rats liver under melatonin action at norm and toxic hepatitis. Bull Exp Biol Med， 2005， 139（5）：520-524.

[16] 李淑麗， 陸善詞， 王軍， 等. 表觀健康成人血清谷胱甘肽還原酶參考區(qū)間的建立. 檢驗醫(yī)學， 2019， 34（10）：908-912.

[收稿日期：2020-01-17]