盛恒煒 磨凱

1南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院麻醉科（廣州510010）；2南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院麻醉科（廣州510280）

正常感覺信息或傷害性信息傳遞依賴于神經(jīng)系統(tǒng)感覺傳導通路中痛覺相關(guān)基因的完整表達[1-2]。該痛覺相關(guān)基因在外周炎癥或神經(jīng)損傷后的表達改變對急慢性疼痛的誘導和維持至關(guān)重要[3]，而且疼痛狀態(tài)下的這些疼痛基因的表達依賴于表觀遺傳調(diào)控[4-5]。甲基-CpG結(jié)合域蛋白1（methyl-CpG-binding domain protein 1，MBD1）是一個具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的表觀遺傳抑制因子[6-7]。筆者最新研究顯示，MBD1 缺失小鼠能緩解神經(jīng)損傷引起的疼痛行為，機制上進一步發(fā)現(xiàn)背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglia，DRG）內(nèi)MBD1 可募集DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3a 到μ阿片受體基因（Oprm1）和鉀通道蛋白Kv1.2 基因（Kcna2）兩個痛覺相關(guān)基因啟動子區(qū)抑制其表達，從而調(diào)控急性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和持續(xù)[8-9]。因此DRG MBD1 可能是急慢性疼痛的發(fā)展和持續(xù)的關(guān)鍵因素。然而，MBD1 缺失緩解完全弗氏佐劑（complete freund′s adjuvant，CFA）誘導的慢性炎性疼痛具體機制仍然不清楚[8]，明確這一機制對慢性炎性疼痛病因治療至關(guān)重要。

慢性炎性疼痛是由多種炎癥介質(zhì)刺激C-類纖維產(chǎn)生動作電位并上傳到脊髓背角，其沖動在脊髓內(nèi)通過背根反射逆行傳到感受外周傷害性刺激的神經(jīng)末梢，導致神經(jīng)肽和神經(jīng)遞質(zhì)生成和釋放增加，造成血管擴張和滲出增多等炎癥反應，在外周和中樞形成一個正反饋，促進炎性疼痛的發(fā)展和持續(xù)[10-12]。這些神經(jīng)肽和神經(jīng)遞質(zhì)包括降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）、P 物質(zhì)、神經(jīng)激肽A和速激肽等，其中CGRP 在介導炎性疼痛發(fā)展和持續(xù)中發(fā)揮重要作用[13-14]。那么，MBD1 缺失是否通過抑制背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角區(qū)CGRP的生成與釋放，從而緩解慢性炎性疼痛產(chǎn)生和持續(xù)，目前尚未見報道?；诖?，本研究擬采用MBD1 敲除小鼠構(gòu)建小鼠CFA誘導的炎性疼痛模型，檢測DRG和脊髓背角內(nèi)CGRP 含量改變，探討MBD1 缺失對慢性炎性疼痛調(diào)控的具體機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

1.1.1 實驗動物野生型小鼠（wildtype，WT）選用SPF級健康雄性8 周齡C57BL6J 小鼠，體質(zhì)量約25～30 g 小鼠，由南方醫(yī)科大學動物實驗室提供；同時選取年齡、性別和體質(zhì)量相符的MBD1 敲除小鼠（knockout，KO）與之配對，MBD1 KO 小鼠由美國羅格斯大學新澤西醫(yī)學院提供，其遺傳背景與C57BL6J小鼠完全相同，其敲除方法見文獻[8，15]。

1.1.2 分組根據(jù)處理方式不同，按隨機數(shù)字表法分為4組，分別為做足底注射生理鹽水（normal saline，NS）、CFA的WT小鼠組和注射NS、CFA的KO小鼠組（每組7 只）。小鼠鼠分籠飼養(yǎng)，室溫和濕度分別保持在24±1℃和50%～60%，白天（12 h）一黑夜（12 h）循環(huán)照明，實驗前對小鼠進行適應性飼養(yǎng)l 周，本研究依據(jù)國際疼痛研究學會（IASP）準則和學校動物倫理委員會許可實施小鼠疼痛實驗。

1.2 MBD1基因敲除小鼠的飼養(yǎng)繁育與基因型鑒定由美國羅格斯大學新澤西醫(yī)學院提供的3 只MBD1-/-雄小鼠（純合子）和3 只MBD1+/-雌小鼠（雜合子），該小鼠的遺傳背景為C57BL/6。因雌MBD1-/-純合子小鼠生育力極低，本研究采用一只MBD1-/-純合子雄鼠和一只MBD1+/-雜合子雌鼠同居交配繁育的方式進行繁殖。新生小鼠出生第5～7 d時，無菌條件下將小鼠距離尾端3 mm的鼠尾組織剪斷，標記后置于離心管中。每個離心管中各加入600 μL 50 mmol/L的NaOH 溶液，置于99℃金屬浴中煮20 min。冷卻至室溫后，將每個離心管中各加入100 μL 1M Tris-HCl（pH-7.4），混勻后轉(zhuǎn)移到離心機中以10 000g離心管5 min。轉(zhuǎn)移上清100 μL至新的離心管中可存于-20℃冰箱備用。18 μL PCR 反應體系：GoTaq Green Master Mix，2×（Promega 公司，M7122）9.0 μL，上下游引物混合物1 μL，DNA 模板2 μL，dH2O 6.0 μL。反應條件為：第1 步94 °C 1 min 預變性，第2 步94℃變性1 min，63℃退火1 min，72℃延伸1 min，共40個循環(huán)，第3 步72℃5 min，第4 步冷卻到20℃后反應結(jié)束。取10 μL PCR 產(chǎn)物加入含6 μL 溴化乙啶的100 mL 電泳緩沖液制備的2%瓊脂糖膠板上樣孔內(nèi)，電泳槽中電泳（135 V）20 min，然后置入凝膠成像儀中進行成像保存并觀察電泳條帶，依照特定的基因條帶對各個小鼠的基因型進行鑒定（圖1）?；蛐丸b定引物序列：WT 正義鏈5′-TCTTCTCAGACTGAGGAAGGGTGA-3′，反義鏈：5′-CAAGGTCCAACGCCACTGAACAT-3′，350 bp；KO 正義鏈：5′-GGATTCTCCGTGGGAACAAACG-3′，反義鏈：5′-CAAGGTCCAACGCCACTGAACAT-3′，450 bp。

圖1 基因型鑒定典型圖Fig.1 Genotype identification

1.3 CFA慢性炎性痛模型制備按50%乳化的弗氏完全佐劑（complete freund′s adjuvant，CFA，美國Sigma 公司）10 μL 皮下注射到小鼠左足底（等量的生理鹽水做對照）建立CFA 炎性疼痛模型，4組小鼠分別于注射前1 天（-1 d）、注射后2 h、1、3、7和14 d 測定機械痛閾和輻射熱痛閾，具體方法如下。

1.4 小鼠疼痛行為學測定

1.4.1 機械痛閾測定CFA注射前（-1 d）、注射后2 h、1、3、7和14 d時，各組小鼠放置于有機玻璃箱內(nèi)適應30 min 安靜后，使用0.4 g von Frey 細絲測定各組小鼠后肢機械痛閾。方法同既往文獻，即將纖毛絲垂直刺激各小鼠后足底中部，當小鼠受刺激出現(xiàn)縮足、抬腿，記做1次陽性反應，連續(xù)刺激10次，每次間隔5 s，記錄10次刺激中出現(xiàn)陽性反應的頻數(shù)，完成各組測試后計算縮爪反應頻率（paw withdrawal frequency，PWF）=（有效反應次數(shù)/10）×100%，以此評定小鼠機械痛閾。

1.4.2 輻射熱痛閾測定CFA注射前（-1 d）、注射后2 h、1、3、7和14 d時，各組小鼠放置于恒溫的玻璃臺上的有機玻璃籠內(nèi)，維持小鼠足底皮膚的溫度恒定，室溫穩(wěn)定在22～24℃，30 min 適應環(huán)境后，采用熱輻射刺激儀（美國life science instruments 公司）照射小鼠的后足底中部，記錄從照射開始到小鼠出現(xiàn)抬足的時間，記為熱縮足反應潛伏期（paw withdrawal latency，PWL），來判定小鼠熱痛敏情況。輻射適宜強度調(diào)整為8～12 s，設置刺激切斷時間為20 s 以免熱輻射灼傷小鼠皮膚，每次刺激間隔15 min，連續(xù)刺激5次，記錄5次測量的平均值作為該后爪PWL 值。

1.5 ELISA法測 定DRG和脊髓 背角CGRP 含量 另取上述4組小鼠（每組3 只）于CFA注射后1天（CFA 致痛最明顯時點）機械痛閾和熱痛閾測定結(jié)束后，七氟醚深度麻醉后處死，快速取出患側(cè)和對側(cè)L3和L4 DRG組織和腰膨大處脊髓患側(cè)和對側(cè)背段。按CGRP EIA 試劑盒（法國SPI-BIO 公司）操作說明，取出4組患側(cè)脊髓背角組織（左側(cè)）冰上化解后稱重，按5 mL：1 g組織加入2N 乙酸（即：5.88 mL 乙酸加44.12 mL 配置成50 mL 溶液）充分勻漿，90℃加熱10 min，1 500g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至新管，負壓離心空干上清后獲得沉于管底的固態(tài)顆粒，等乙酸體積的EIA 緩沖液重懸溶解，根據(jù)我們既往經(jīng)驗，重懸液按1∶50 稀釋成200 μL備用。檢測前每孔加入300 μL 漂洗液，倒扣空干，反復漂洗5次封閉非特異性抗原表位。每排第1 孔做空白孔（Blank），第2 孔加100 μL EIA 緩沖液陰性對照，第3和4 孔依次滴加8個標準樣品（100 μL），2個重復測定標準曲線，其余4 孔滴加稀釋好的100 μL上述4組樣品，每個樣品3個重復；隨后每孔加入100 μL anti-CGRP AchE 標記物，塑封后4℃孵育16 h。孵育結(jié)束，倒置空干，300 μL漂洗液震蕩2 min 漂洗3次后，每孔加入200 μL Ellman′s 顯色試劑，鋁箔紙避光，震蕩45 min，設置波長為405 nm的自動化酶標儀（美國Bio-Tek 公司）讀取吸光度。數(shù)據(jù)分析：各組吸光度值減去空白孔均值，根據(jù)8 點標準曲線計算各樣品CGRP 濃度，將所有組校正到WT-NS組，以倍數(shù)表達比較組間差異。

1.6 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)分析采用SigmaPlot 12.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，多重比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用Tukey 法檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠患側(cè)PWF的比較CFA注射后2 h、1、3、7和14 d，4組小鼠患側(cè)PWF 比較差異有統(tǒng)計學意義（F= 268.093，P＜0.001）。與注射生理鹽水的WT 小鼠組比較，注射CFA的WT 小鼠患側(cè)PWF 增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而與注射CFA的KO 小鼠患側(cè)相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖2）。表明MBD1 缺失顯著緩解CFA誘導的機械痛覺過敏。

圖2 4組小鼠患側(cè)PWF的比較（n=7）Fig.2 Comparation of hind paw withdrawal frequency of ipsilateral sides in vehicle and CFA treated wildtype or Mbd1-/-mice at before 1 day，2 hours，1 day，3 days，7 days and 14 days after CFA injection（n=7）

2.2 4組小鼠對側(cè)PWF的比較CFA注射前（-1 d）以及注射后2 h、1、3、7和14 d，4組小鼠對側(cè)PWF 比較差異有統(tǒng)計學意義（F= 191.525，P＜0.001）。與注射生理鹽水的WT 小鼠對側(cè)后爪比較，注射CFA的WT 小鼠對側(cè)后爪PWF 無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而與注射生理鹽水和CFA的KO 小鼠對側(cè)后爪相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖3）。表明MBD1 缺失可提高小鼠對機械刺激的基礎痛閾。

圖3 4組小鼠對側(cè)PWF的比較（n=7）Fig.3 Comparation of hind paw withdrawal frequency of contralateral sides in vehicle and CFA treated wildtype or Mbd1-/-mice at before 1 day，2 hours，1 day，3 days，7 days and 14 days after CFA injection（n=7）

2.3 4組小鼠患側(cè)PWL的比較CFA注射后2 h、1、3、7和14 d，4組小鼠患側(cè)PWL 比較差異有統(tǒng)計學意義（F= 797.954，P＜0.001）。與注射生理鹽水的WT 小鼠組比較，WT 小鼠在CFA注射后2 h、1、3、7和14 d的PWL 明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而與注射CFA的KO 小鼠患側(cè)相比，僅在CFA注射后1 d 有差異（P＜0.05），其余差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖4），表明MBD1 缺失可緩解CFA注射側(cè)后爪引起的熱痛覺過敏。

圖4 4組小鼠患側(cè)PWL的比較（n=7）Fig.4 Comparation of hind paw withdrawal latency of ipsilateral sides in vehicle and CFA treated wildtype or Mbd1-/-mice at before 1 day，2 hours，1 day，3 days，7 days and 14 days after CFA injection（n=7）

2.4 4組小鼠對側(cè)PWL的比較在CFA注射前（-1 d）以及注射后2 h、1、3、7和14 d的時間點，4組小鼠對側(cè)PWF 比較差異有統(tǒng)計學意義（F=290.491，P＜0.001）。與注射生理鹽水的WT 小鼠對側(cè)后爪比較，注射CFA的WT 小鼠對側(cè)后爪PWF 無明顯差異（P＞0.05），而與注射生理鹽水和CFA的KO 小鼠對側(cè)后爪相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖5）。表明MBD1 缺失小鼠可更好的耐受熱傷害性刺激。

圖5 4組小鼠對側(cè)PWF的比較（n=7）Fig.5 Comparation of hind paw withdrawal latency of contralateral sides in vehicle and CFA treated wildtype or Mbd1-/-mice at before 1 day，2 hours，1 day，3 days，7 days and 14 days after CFA injection（n=7）

2.5 4組小鼠患側(cè)DRG內(nèi)CGRP 含量的比較CFA注射后1 d，4組小鼠患側(cè)L3/4 DRG 內(nèi)CGRP含量比較差異有統(tǒng)計學意義（F= 64.384，P＜0.001）。與注射生理鹽水的WT 小鼠組比較，WT小鼠DRG 內(nèi)CGRP 顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），注射生理鹽水的KO 小鼠DRG 內(nèi)CGRP 顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而注射CFA的KO 小鼠DRG 內(nèi)CGRP 無明顯變 化（P＞0.05，圖6），表明MBD1 缺失可抑制CFA 引起的DRG 內(nèi)CGRP 含量增加。

2.6 4組小鼠患側(cè)脊髓背角內(nèi)CGRP含量的比較 CFA注射后1 d，4組小鼠患側(cè)腰膨大處脊髓背角內(nèi)CGRP 含量變化差異有統(tǒng)計學意義（F=19.019，P＜0.001）。與注射生理鹽水的WT 小鼠組比較，WT 小鼠脊髓背角內(nèi)CGRP 含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），注射生理鹽水的KO 小鼠脊髓背角內(nèi)CGRP 顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而注射CFA的KO 小鼠脊髓背角內(nèi)CGRP 無明顯變化（P＞0.05，圖7），表明MBD1 缺失可抑制CFA 引起的脊髓背角內(nèi)CGRP含量增加。

圖6 4組小鼠患側(cè)DRG 內(nèi)CGRP 含量的比較（n=3）Fig.6 Comparation of CGRP content of L3/4 ipsilateral sides of dorsal root ganglia in four group mice at 1 day after CFA injection（n=3）

圖7 4組小鼠患側(cè)脊髓背角內(nèi)CGRP 含量的比較（n=3）Fig.7 Comparation of CGRP content of L3/4 ipsilateral sides of spinal dorsal horn in four group mice at 1 day after CFA injection（n=3）

3 討論

傷害性疼痛是維持機體完整所必需的重要組成部分，是抵御外界侵擾和適應環(huán)境重要神經(jīng)活動[16]。在有/無外界傷害性刺激下，炎癥性疼痛即可引起機械和熱刺激痛覺過敏，部分原因是炎癥引起炎癥介質(zhì)釋放導致神經(jīng)傳導通路中的DRG和脊髓背角區(qū)神經(jīng)肽CGRP 生成和釋放增加導致中樞敏化[17-18]。本研究結(jié)果顯示，MBD1 缺失小鼠緩解CFA 誘導的炎性疼痛引起機械和熱刺激痛覺過敏，可能是通過抑制DRG和脊髓背角區(qū)神經(jīng)肽CGRP 生成和釋放來實現(xiàn)，表明MBD1是調(diào)控慢性炎性疼痛重要的關(guān)鍵因子。

慢性疼痛的形成被認為是由炎癥、組織損傷和/或神經(jīng)損傷引起DRG、脊髓背角和疼痛相關(guān)的腦區(qū)感覺神經(jīng)元基因表達的變化引起[19]。CGRP作為疼痛因子參與炎性、軀體性、內(nèi)臟性和神經(jīng)性等多種慢性疼痛的過程，其表達亦受包括表觀遺傳機制在內(nèi)的多種因子調(diào)控[20-21]。越來越多的研究表明，CGRP 在外周神經(jīng)元、脊髓背角上調(diào)，促進傷害性信號傳播，介導外周敏化加劇炎癥和神經(jīng)性疼痛中起著關(guān)鍵作用[22-23]。抑制其表達對緩解慢性疼痛的產(chǎn)生和維持至關(guān)重要。表觀遺傳修飾是控制基因表達的重要方式，參與了慢性疼痛的發(fā)生和持續(xù)過程[24]。DNA 甲基化作為表觀遺傳修飾控制基因表達的重要方式之一，可通過多種機制抑制基因轉(zhuǎn)錄，包括甲基-CpG結(jié)合域蛋白（MBD）家族作為轉(zhuǎn)錄抑制因子或共抑制因子結(jié)合到啟動子區(qū)CpG 島抑制轉(zhuǎn)錄活動[6，25]。本研究發(fā)現(xiàn)，對甲基化結(jié)合域蛋白MBD1 進行小鼠敲除，可以有效緩解小鼠CFA注射后14 d 內(nèi)的炎性疼痛行為。進一步通過選取疼痛最明顯的時點（CFA注射后1 d）取材檢測，進一步發(fā)現(xiàn)MBD1 敲除可降低DRG和脊髓背角區(qū)域神經(jīng)肽CGRP 總水平，進而抑制CFA 炎性誘導引起的CGRP 生成和釋放增加。另外，本課題組發(fā)現(xiàn)DRG 神經(jīng)元細胞核內(nèi)的MBD1 蛋白與CGRP 標記物共表達于同一個DRG小神經(jīng)元內(nèi)[8]。上述研究結(jié)果表明，MBD1 敲除緩解慢性炎性疼痛可能是通過下調(diào)DRG和脊髓背角神經(jīng)肽CGRP的生成與釋放來實現(xiàn)。然而，本研究仍然不清楚MBD1 敲除具體影響到哪種神經(jīng)細胞CGRP的分泌和釋放，筆者將在以后的實驗中使用離體原代細胞去進一步驗證。

綜上所述，小鼠DRG和脊髓背角區(qū)域內(nèi)神經(jīng)肽CGRP 表達上調(diào)參與了CFA 誘導的慢性炎性疼痛形成；MBD1 敲除可緩解CFA 誘導的機械和熱刺激痛覺過敏，機制可能與抑制DRG和脊髓背角內(nèi)CGRP 生成和釋放有關(guān)。