曾斯杰，馬金爽，王 玥，劉彥弟，尹 星，韓長(zhǎng)日，楊定國(guó)，劉 紅*

（1.海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海口市熱帶特色藥食同源植物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571158；2.海南科技職業(yè)大學(xué)，藥食同源植物資源海南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571126；3.廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004）

青金桔，又名青桔、山桔、綠桔，屬蕓香科水果，果汁氣味芳香、獨(dú)特。青金桔富含維生素C、維生素A、維生素P和芳香油、類胡蘿卜素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)眼疾、咳嗽、哮喘、高血壓、防止動(dòng)脈硬化等疾病有一定保健作用[1-3]。青金桔果實(shí)經(jīng)過清洗、榨汁、噴霧干燥、包裝等工序制得青金桔果粉。果粉在儲(chǔ)存過程中，人為改變高溫高濕環(huán)境會(huì)促進(jìn)微生物增殖。果粉中細(xì)菌或霉菌總數(shù)的快速檢測(cè)，成為近幾年研究的熱點(diǎn)。

傳統(tǒng)微生物總數(shù)的檢測(cè)方法主要是微菌落技術(shù)法、全平器計(jì)數(shù)法、阻抗法、紙片法、平板計(jì)數(shù)法等[4-6]，其中平板計(jì)數(shù)法相對(duì)于其他方法，在精確度、敏感性、檢測(cè)速度等方面都有了較大的提高，但仍存在操作過程繁瑣，成本昂貴，易受溫度、濕度、酸堿度等影響，而且檢測(cè)周期太長(zhǎng)，難以進(jìn)行大批量檢測(cè)。微生物檢測(cè)只能通過抽檢來進(jìn)行，很難保證食品的安全性[7]。因此，尋找一種先進(jìn)的快速檢測(cè)技術(shù)來實(shí)現(xiàn)微生物總數(shù)檢測(cè)勢(shì)在必行。

近紅外光譜技術(shù)是近年來快速發(fā)展起來的一種新的分析手段[8]，在食品的營(yíng)養(yǎng)成分和微生物檢測(cè)、摻假鑒定等方面應(yīng)用前景廣闊。近紅外光譜技術(shù)具有快速、無損、無需預(yù)處理的特點(diǎn)，可用于乳酸菌、癌細(xì)胞、致病菌的檢測(cè)，大大優(yōu)于傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)[9-12]。GHANI利用近紅外光譜技術(shù)對(duì)HeLa和DU145細(xì)胞進(jìn)行特征鑒別和含量測(cè)定[13]，F(xiàn)ERNáNDEZ 報(bào)道了近紅外光譜檢測(cè)生物膜表面金黃色葡萄球菌[14]，Treguier 利用近紅外光譜從牛奶的微生物鑒別大腸桿菌和乳酸菌[15]?？梢娊t外漫反射光譜可用于食品中微生物的定量分析。

青金桔果粉在一定的濕度下，一定培養(yǎng)溫度和時(shí)間適合微生物的生長(zhǎng)。在27 ℃下適合酵母菌和霉菌、35 ℃有利于培養(yǎng)大腸桿菌等微生物的生長(zhǎng)，如實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)1～7 d，細(xì)菌總數(shù)明顯增加。通過掃描不同溫度下保存1～7 d的青金桔果粉的近紅外光譜，獲得果粉中大腸桿菌、酵母菌和霉菌等微生物含氫基團(tuán)的特征信息，結(jié)合與樣品微生物總數(shù)的測(cè)定值，利用偏最小二乘法建立預(yù)測(cè)模型以實(shí)現(xiàn)對(duì)青金桔粉菌落總數(shù)的快速檢測(cè)[16-19]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青金桔原粉，海南南派實(shí)業(yè)有限公司;酵母浸膏，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌瓊脂粉，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；胰蛋白胨，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

SUP-NIR-1520近紅外光譜分析儀，江蘇潤(rùn)安光電箱公司；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器，上海申賢恒溫設(shè)備廠；MLS-3751L高溫滅菌器，日本Panasonic。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

準(zhǔn)確稱取36 g青金桔原粉于滅菌燒杯中，加入4 mL超純水，混勻后均勻的鋪在直徑為9 cm的無菌培養(yǎng)皿中。本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置三組不同溫度（0、27、35 ℃），培養(yǎng)1～7 d，每組8個(gè)樣品（20 ℃樣品做參考對(duì)照），每天取1個(gè)樣品，共25個(gè)青金桔粉測(cè)試樣品。

1.2.2 樣品近紅外信息的采集

為保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不受外界空氣和其他條件影響，每天固定時(shí)間于三種溫度下分別取一個(gè)樣品進(jìn)行近紅外光譜掃描。波長(zhǎng)范圍為900～1700 nm，掃描次數(shù)為5次，儀器分辨率為8 cm-1，采樣間隔為3.856 cm-1。運(yùn)用近紅外光譜分析儀分別對(duì)樣品進(jìn)行掃描，保存光譜數(shù)據(jù)。

1.2.3 樣品菌落總數(shù)的測(cè)定

對(duì)采集近紅外光譜圖像信息后的樣品進(jìn)行菌落總數(shù)的測(cè)定。取出樣品0.25 g，用超純水溶解稀釋至10 mL。參考GB 4789.2-2010中的10倍稀釋法對(duì)樣品依次進(jìn)行稀釋。將稀釋后的樣品置于培養(yǎng)皿中，并分別倒入霉菌、酵母菌、大腸桿菌的培養(yǎng)液，30 ℃搖床中培養(yǎng)6～8 d，通過平板劃線法測(cè)出它們的總數(shù)。

1.2.4 模型的建立與驗(yàn)證

為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，將每個(gè)樣品掃描3次的光譜數(shù)據(jù)取平均值，分別與不同微生物的菌落總數(shù)相對(duì)應(yīng)，并分成校正集（2/3）和預(yù)測(cè)集（1/3）。采用The Unscrambler 軟件應(yīng)用偏最小二乘法將測(cè)定值和光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行建?；貧w，建立青金桔粉的霉菌、酵母菌、大腸桿菌總數(shù)的預(yù)測(cè)模型。采用校正決定系數(shù)R2c 校正驗(yàn)證誤差（RMSEC）以及交互驗(yàn)證決定系數(shù)（R2cv）、交互驗(yàn)證誤差（RMSEC）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)判定定標(biāo)模型的可行性，然后再用預(yù)測(cè)集進(jìn)行驗(yàn)證，評(píng)價(jià)指標(biāo)為預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RMSEP）、預(yù)測(cè)決定系數(shù)（R2p）。一般情況下RMSEC、RMSECV越小，R2c、R2cv、R2p越接近1，定標(biāo)模型的預(yù)測(cè)能力越好，反之越差[20]。

2 結(jié)果與討論

2.1 青金桔粉的近紅外光譜分析

青金桔粉按照1.2.1 保存7 d，每天取樣，掃描樣品的近紅外光譜，1～7 d 樣品透射率在全波長(zhǎng)（900～1700 nm）范圍的變化關(guān)系如圖1A所示。樣品的透射率受溫度影響較明顯，其中原始溫度（20 ℃）的反射率最小，0 ℃次之，35 ℃最大。近紅外光譜顯示葡萄糖在1681 nm處有吸收峰，而青金桔粉H2O含氫官能團(tuán)吸收波長(zhǎng)為1460 nm，波長(zhǎng)越來越小，即這些分子含氫官能團(tuán)振動(dòng)所需要的能量依次增大[21]。

2.2 青金桔粉近紅外光譜的主成份分析

將上述近紅外光譜進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如圖1B所示。貯藏溫度對(duì)光譜數(shù)據(jù)的影響較大，0 ℃處理的青金桔粉在圖中左側(cè)，PC2 在67.9%～98.7%范圍；27 ℃處理的青金桔粉在圖的中部，PC2 在48.5%～57.9%范圍，主要含有大量的霉菌和酵母菌；35 ℃處理的青金桔粉位于圖中右側(cè)，PC2在29.0%～48.5%范圍，含有一定量的大腸桿菌。常溫存放的青金桔粉（4號(hào)樣品）PC2大于1，說明溫度的變化引起青金桔光譜的反射率增大。

圖1青金桔粉的近紅外光譜和主成份分析Figure 1 Near-infrared spectra of green kumquat powder and principal component analysis

2.3 不同波長(zhǎng)選擇對(duì)青金桔粉各菌種建模和預(yù)測(cè)的影響

通過PLS法對(duì)青金桔粉各菌屬在900～1700 nm和1300～1700 nm兩個(gè)波段內(nèi)的光譜數(shù)據(jù)和微生物總數(shù)進(jìn)行建模分析，得出的青金桔粉微生物總數(shù)的預(yù)測(cè)模型，如表1所示。在波長(zhǎng)900～1700 nm范圍內(nèi)，霉菌和酵母菌模型的校正、交叉驗(yàn)證和預(yù)測(cè)決定系數(shù)R2c、R2cv 和R2p 分別為0.9861、0.9839、0.9823 和0.8794、0.6506、0.8264，這說明霉菌和酵母菌在近紅外光譜圖的特征峰相對(duì)均勻的分布在900～1700 nm范圍。而大腸桿菌模型的校正、交叉驗(yàn)證和預(yù)測(cè)決定系數(shù)在1300～1700 nm范圍內(nèi)，R2c、R2cv和R2p為0.9610、0.9570和0.9787，由此可以分析得到，運(yùn)用近紅外光譜檢測(cè)大腸桿菌時(shí)，選擇波長(zhǎng)1300～1700 nm 能在減小工作量的同時(shí)，提高數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。

表1 不同波長(zhǎng)對(duì)各菌建模和預(yù)測(cè)的影響Table 1 Effects of different wavelengths on the modeling and prediction of various bacteria

2.4 不同光譜預(yù)處理方法對(duì)青金桔粉各菌種建模和預(yù)測(cè)的影響

對(duì)900～1700 nm范圍內(nèi)的霉菌和酵母菌，1300～1700 nm范圍內(nèi)的大腸桿菌的光譜數(shù)據(jù)分別使用平滑（S-G）、歸一化和標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變化三種不同的預(yù)處理方式進(jìn)行處理，通過PLS法建模并預(yù)測(cè)，得到的結(jié)果如表2所示。原始光譜的建模和預(yù)測(cè)效果整體更為穩(wěn)定，而其他預(yù)處理方式能夠得到更加穩(wěn)定的建模數(shù)據(jù)，預(yù)測(cè)模型效果則不理想。這可能跟樣品儲(chǔ)藏時(shí)間過長(zhǎng)，微生物生長(zhǎng)的穩(wěn)定態(tài)被破壞，在通過對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理后使預(yù)測(cè)模型波動(dòng)太大導(dǎo)致。

表2 不同光譜預(yù)測(cè)方式對(duì)各菌建模和預(yù)測(cè)的影響Table 2 Effects of different spectral prediction methods on the modeling and prediction of various bacteria

2.5 微生物總數(shù)建模分析

采集不同溫度、時(shí)間的霉菌、酵母菌和大腸桿菌中的菌落總數(shù)，每種菌種共25個(gè)測(cè)定值。從25組數(shù)據(jù)中隨機(jī)選擇16組作為校正集，用于模型建立；其余9組作為驗(yàn)證集，用于模型預(yù)測(cè)。利用The Unscrambler軟件中的PLS將霉菌、酵母菌、大腸桿菌的光譜數(shù)據(jù)和微生物總數(shù)相關(guān)聯(lián)，建立預(yù)測(cè)青金桔粉中霉菌、酵母菌、大腸桿菌總數(shù)的近紅外模型（圖2）。

圖2 基于近紅外光譜數(shù)據(jù)的霉菌總數(shù)、酵母菌總數(shù)和大腸桿菌總數(shù)PLS建模和預(yù)測(cè)結(jié)果Figure 2 PLS calibration and prediction results for the total mold counts (A1，A2)，the total yeast counts（B1，B2)and the total E.coli counts(C1，C2)based on near-infrared spectra

從圖2可知，霉菌總數(shù)的近紅外光譜數(shù)據(jù)模型的校正、交叉驗(yàn)證和預(yù)測(cè)的相關(guān)系數(shù)、和均大于0.98，均方根誤差RMSEC、RMSECV和RMSEP均小于2.70（lg CFU/g），說明霉菌總數(shù)預(yù)測(cè)模型的擬合程度良好，真實(shí)值與預(yù)測(cè)結(jié)果具有一定相關(guān)性。酵母菌總數(shù)的近紅外光譜數(shù)據(jù)模型的校正、交叉驗(yàn)證、預(yù)測(cè)的相關(guān)系數(shù)、、均大于0.65，均方根誤差RMSEC、RMSECV和RMSEP均小于6.20（lg CFU/g），說明模型的擬合程度中等。大腸桿菌總數(shù)的近紅外光譜數(shù)據(jù)模型的校正、交叉驗(yàn)證和預(yù)測(cè)的相關(guān)系數(shù)、、均大于0.93，均方根誤差RMSEC、RMSECV和RMSEP均小于1.70（lg CFU/g），說明模型的擬合程度較好，數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)較為準(zhǔn)確。上述結(jié)果表明，近紅外光譜可用大腸桿菌和霉菌總數(shù)測(cè)定，預(yù)測(cè)效果較好，而預(yù)測(cè)酵母菌總數(shù)模型可行，可能與酵母菌難以計(jì)數(shù)有關(guān)。

3 結(jié)論

在運(yùn)用傳統(tǒng)的平板計(jì)數(shù)法測(cè)定了在不同溫度、時(shí)間下處理的青金桔粉中霉菌、酵母菌、大腸桿菌的菌落總數(shù)基礎(chǔ)上，結(jié)合青金桔粉樣品的近紅外光譜數(shù)據(jù)，運(yùn)用偏最小二乘法建立菌落總數(shù)的預(yù)測(cè)模型，青金桔粉中霉菌、大腸桿菌近紅外光譜預(yù)測(cè)模型的相關(guān)系數(shù)均大于0.9，酵母菌的校正和預(yù)測(cè)模型的相關(guān)系數(shù)、均大于0.8，且它們的均方根誤差RMSE都較小，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，所建立的模型可有效預(yù)測(cè)青金桔粉中的霉菌、大腸桿菌總數(shù)。