康 靜，劉玉青，胡煥煥,豐慧根

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)453003)

基于生物質(zhì)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)的生物柴油是當(dāng)今最為理想的可再生燃料之一[1]。圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)是目前研究較多的高產(chǎn)油脂菌種，作為生物柴油的原料，與藻類或植物生物柴油相比，它可在胞內(nèi)積累油脂、類胡蘿卜素等[2]，它不僅是清潔能源，更具有可持續(xù)生產(chǎn)微生物類脂和工業(yè)化廣泛應(yīng)用的潛力。該菌株經(jīng)酯交換產(chǎn)生生物柴油[3]，但反應(yīng)速率慢，反應(yīng)體系中過多的甲醇和副產(chǎn)物甘油還會影響脂肪酶的活性及穩(wěn)定性[4]。對圓紅冬孢酵母油脂代謝中的關(guān)鍵酶脂肪酸合酶(Fatty acid synthase，F(xiàn)AS)的結(jié)構(gòu)特征及理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，可以為下一步構(gòu)建產(chǎn)油工程菌奠定基礎(chǔ)，也為生物柴油及其他相關(guān)行業(yè)的原料油脂資源和廢棄物的再利用提供新的思路[5]。

1 材料與方法

1.1 FAS基因序列的Genbank檢索

在NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫中檢索圓紅冬孢酵母脂肪酸合酶，其基因序列編碼為XM_016415817.1，氨基酸序列編碼為XP_016272387.1。

1.2 FAS的生物信息學(xué)分析及預(yù)測

1.2.1 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索20種生物FAS氨基酸序列，利用MEGA7.0軟件對20種生物相應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行遺傳距離的分析，構(gòu)建出FAS的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 使用在線生物信息學(xué)預(yù)測工具

ProtParam：對FAS進(jìn)行理化性質(zhì)的預(yù)測，如分子量、等電點、原子構(gòu)成、氨基酸組成、摩爾消光系數(shù)、半衰期、脂溶指數(shù)等；ProtScale：對FAS進(jìn)行親水參數(shù)的預(yù)測；TMpred：對 FAS 進(jìn)行跨膜區(qū)域的預(yù)測；SigalP：對FAS進(jìn)行信號肽的預(yù)測；PredictNLS：對FAS進(jìn)行核輸出信號的預(yù)測；SOPMA和PredictProtein：對FAS進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)折疊類型的預(yù)測分析；SMART：對FAS進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的預(yù)測與分析。

2 結(jié)果

2.1 FAS進(jìn)化樹的構(gòu)建

使用鄰位相連法(Neighbor-joining，NJ 法)構(gòu)建FAS的系統(tǒng)進(jìn)化樹，如圖1所示。將20種FAS的氨基酸序列對齊后，使用軟件MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖1可知，該FAS與紅酵母屬的菌種都具有較高同源性，且進(jìn)化位置上也比其他菌種要高。

圖1 圓紅冬孢酵母FAS系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 氨基酸的組成

利用在線軟件Protparam對該FAS編碼的氨基酸組成進(jìn)行初步預(yù)測分析。如圖2所示，預(yù)測結(jié)果：該FAS編碼區(qū)的氨基酸數(shù)目為2928個，其中含量較多的氨基酸為Ala(311個，10.6%)，Leu(260個，8.9%)和Gly(250個，8.5%)。該FAS氨基酸中，帶正電的總數(shù)殘基/酸性氨基酸(Arg+Lys=320)少于帶負(fù)電的總數(shù)殘基/堿性氨基酸(Asp+Glu=338)[6]。它還含有17個半胱氨酸，說明該蛋白可能具有二硫鍵。它沒有Pyl(O)Sec(U)(B)(Z)(X)氨基酸。該FAS的氨基酸組成分別為：Ala(10.6%)，Arg(4.5%)，Asn(3.0%)，Asp(5.0%)，Cys(0.6%)，Gln(4.0%)，Glu(6.5%)，Gly(8.5%)，His(1.9%)，Ile(5.4%)，Leu(8.9%)，Lys(6.4%)，Met(2.3%)，Phe(3.5%)，Pro(4.9%)，Ser(6.7%)，Thr(6.1%)，Trp(1.1%)，Tyr(3.1%)以及Val(7.0%)。

圖2 圓紅冬孢酵母FAS的氨基酸組成分布圖

2.3 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

利用在線軟件ProtParam對FAS理化性質(zhì)的各個參數(shù)進(jìn)行初步預(yù)測分析，得到結(jié)果如下：該蛋白的原子構(gòu)成為C14186H22484N3858O4275S84，原子總數(shù)44887，相對理論分子量為318178.90道爾頓，理論等電點pI值為6.39。對于該蛋白的摩爾消光系數(shù)(Molar Extinction Coefficient)，以M-1cm-1為單位，在水中280nm處測定。假設(shè)該FAS所有的胱氨酸殘基以半胱氨酸的形式出現(xiàn)，即形成二硫鍵，此時該蛋白的消光系數(shù)值為312590L/(mol·cm)，0.1%濃度(1g/L)的吸光度(A280)為0.982；假設(shè)二硫鍵全部打開，該蛋白的消光系數(shù)值為311590L/(mol·cm)，0.1%濃度(1g/L)的吸光度(A280)為0.979[6]。當(dāng)其成熟肽N端為Met甲硫氨酸時，F(xiàn)AS的估計半衰期在體外哺乳動物網(wǎng)織紅細(xì)胞為30h，在酵母體內(nèi)半衰期大于20h，在大腸桿菌體內(nèi)半衰期大于10h。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為38.47，可知該FAS為穩(wěn)定蛋白(定義當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的穩(wěn)定系數(shù)<閾值40時，其在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定)。該蛋白脂肪指數(shù)為86.64，親水性為-0.199。對于蛋白質(zhì)的疏水性/親水性，定義為氨基酸序列中全部氨基酸的親水值總和與氨基酸數(shù)量的比值。負(fù)值越大親水性越好，正值越大疏水性越強(qiáng)。該FAS親水性負(fù)值，表明此蛋白為親水性蛋白。

2.4 疏水性分析

蛋白質(zhì)疏水性/親水性的預(yù)測和分析是進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及功能域劃分的一個必要過程[6]。運用在線軟件ProtScale來預(yù)測該FAS氨基酸序列的疏水性/親水性。由圖3得預(yù)測結(jié)果：該FAS多肽鏈中，第2316位的氨基酸Arg(R)具有最低分值-3.178，第1919位的氨基酸Gly(G)具有最高分值2.400。依據(jù)氨基酸分值越低親水性越強(qiáng)，分值越高疏水性越強(qiáng)的規(guī)律，可以看出第2316位的Arg親水性較強(qiáng)，第1919位的Gly疏水性較強(qiáng)。整個肽鏈中親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，因此整個多肽鏈表現(xiàn)為親水性，可判斷該FAS是親水性蛋白。

圖3 FAS疏水性預(yù)測分析結(jié)果

2.5 FAS跨膜預(yù)測

用TMpred工具對該FAS氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。橫軸為氨基酸位置，縱軸為跨膜預(yù)測得分值，定義預(yù)測分值低于500，顯示不具有跨膜結(jié)構(gòu)。從圖4中可得，對該FAS氨基酸序列跨膜的預(yù)測分值有多個超出500，因此推測該蛋白具有跨膜結(jié)構(gòu)。

圖4 FAS跨膜預(yù)測結(jié)果

2.6 信號肽分析

使用SignalP對該FAS進(jìn)行信號肽預(yù)測，得出該FAS的Signal peptide probability預(yù)測值為0.167，小于臨界值，未發(fā)現(xiàn)信號肽序列(圖5)，因此推算該FAS為非分泌性蛋白(Non-secretory protein)。

圖5 FAS信號肽預(yù)測圖

2.7 FAS核輸出信號分析

使用PredictNLS進(jìn)行核輸出信號預(yù)測。從圖6中可得該蛋白的核輸出信號(nuclear expotr-signal，NES)分值中有超過閾值的，因此可以認(rèn)為該蛋白質(zhì)具有核輸出信號。

圖6 FAS的核輸出信號預(yù)測結(jié)果

2.8 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析

對該FAS的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示該FAS可能包含的二級結(jié)構(gòu)及各個數(shù)據(jù)分別為α-螺旋1302個，占44.47%；β-折疊418個，占14.28%；β-轉(zhuǎn)角184個，占6.28%；無規(guī)則卷曲1024個，占34.97%。α-螺旋及無規(guī)則卷曲是FAS二級結(jié)構(gòu)中最大量的結(jié)構(gòu)元件，而β-折疊和β-轉(zhuǎn)角則散布于整個蛋白質(zhì)中。

2.9 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域分析

利用SMART軟件在線預(yù)測該FAS的結(jié)構(gòu)域，分別是位于第87到第210位氨基酸以及第364到第480位氨基酸的脫水酶(Dehydratase)結(jié)構(gòu)域，位于第495到第872位氨基酸的乙酰轉(zhuǎn)移酶(Acetyl transferase)結(jié)構(gòu)域，位于第2218到第2444位氨基酸以及第2541到第2662位氨基酸的酮酰合酶(Ketoacyl synthase)結(jié)構(gòu)域，位于第2812到第2924位氨基酸的4’-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(Phosphopantetheinyl transferase，PPTase)結(jié)構(gòu)域。

3 討論

脂類作為生化大分子的一員，可以說它已經(jīng)不僅僅是組成微生物細(xì)胞膜的重要部分，還是生物體細(xì)胞內(nèi)許多重要生化反應(yīng)的參與者和調(diào)節(jié)者。它構(gòu)成了細(xì)胞的完整性并參與了免疫防御機(jī)制[7,8]。

生物油脂作為一種生活中的保健食品，其反應(yīng)作用已經(jīng)有較多學(xué)者進(jìn)行研究。隨著不斷出現(xiàn)的各種多不飽和脂肪酸(GLA，EPA，DHA，AA)在抗腫瘤、抗衰老、降血脂、降糖等方面作用的逐步研究，微生物油脂的應(yīng)用有十分廣闊的市場和值得期待的前景[9]。

在對新能源的開發(fā)中，生物柴油作為主要能源備受矚目。它作為與現(xiàn)有石化柴油非常相似的能源，是將甘油三酯轉(zhuǎn)脂化得到的脂肪酸甲脂(或乙脂)，其原料可再生產(chǎn)，且屬于清潔能源，成本上也不用經(jīng)常更換和清洗發(fā)動機(jī)，其分析方法也多種多樣，因此受到廣泛關(guān)注[10]。目前生產(chǎn)生物柴油的原料主要為植物油或廢棄食物油，其生產(chǎn)依賴植物油脂資源。

在適宜條件下，某些微生物可在體內(nèi)積累單細(xì)胞油脂，例如細(xì)菌、酵母和藻類等，尤其是產(chǎn)油脂酵母生長速率快，油脂含量高[11]。圓紅冬孢酵母產(chǎn)生的油脂具有與植物油類似的脂肪酸組成，是生物柴油生產(chǎn)的潛在替代品。它作為脂滴細(xì)胞生物學(xué)和可持續(xù)化學(xué)生產(chǎn)的模型具有巨大潛力。利用生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)脂肪酸及其衍生物被認(rèn)為是一種可再生且環(huán)境友好的生產(chǎn)模式[12]。

本實驗對圓紅冬孢酵母油脂代謝生化反應(yīng)中重要的脂肪酸合酶進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過研究該蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征，以便預(yù)測其在油脂代謝中所起到的作用，并為下一步構(gòu)建產(chǎn)油工程菌奠定基礎(chǔ)。