梁立婷　陸壯念　楊麗娟　張棟　張淑華　林娜

【摘要】目的 探討廣西黑衣壯兒童IL-22基因rs1179251、rs2227485位點的多態(tài)性分布特點和不同人群間的多態(tài)性差異。方法 采取多重單堿基延伸法（SNaPshot）與DNA測序相結(jié)合的方法對115例廣西黑衣壯健康兒童的IL-22基因rs1179251、rs2227485位點進行基因分型檢測，并用統(tǒng)計學(xué)方法比較不同性別及人群分布差異。結(jié)果 廣西黑衣壯健康兒童IL-22基因rs1179251和rs2227485分別存在CC、CG、GG和GG、AG、AA三種基因型。rs1179251、rs2227485兩位點基因型及等位基因頻率在廣西黑衣壯健康兒童人群中男女性別間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。rs1179251位點基因型及等位基因與人類基因組計劃項目（Hap Map）公布的HapMap-YRI、HapMap-MKK均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與HapMap-HCB、HapMap-JPT、HapMap-GIH相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。rs2227485位點各基因型及等位基因分布頻率與HapMap-MKK比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與HapMap-HCB、HapMap-JPT、HapMap-YRI、HapMap-GIH相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 IL-22基因rs1179251、rs2227485基因位點多態(tài)性在不同種族和地區(qū)間存在差異。

【關(guān)鍵詞】白細胞介素22;單核苷酸多態(tài)性;黑衣壯;種族

中圖分類號：R394.5 文獻標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.03.007

Genetic polymorphisms of IL-22 （rs1179251 and rs2227485） in Black-clothes Zhuang children in Guangxi

LIANG Liting1，2，LU Zhuangnian2，YANG Lijuan2，ZHANG Dong2，ZHANG Shuhua2，LIN Na1

（1.Department Pediatrics，Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，2.Graduate School，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi，China）

【Abstract】Objective To explore the distribution characteristics of polymorphisms of interleukin-22（IL-22） （rs1179251，rs2227485） in Black-clothes Zhuang children in Guangxi and its comparison with different ethnic groups.Methods Polymorphisms of IL-22（rs1179251 and rs2227485）in 115 Black-clothes Zhuang children were genotyped by SNaPshot technique and DNA sequencing，and distribution differences between genders and groups were analyzed by statistical methods.Results CC、CG、GG and GG、AG、AA genotypes were respectively observed in rs1179251 and rs2227485 of IL-22 gene in Black-clothes Zhuang children in Guangxi population.There was no significant difference between male and female （P>0.05）.Significant differences were observed between genotypes and alleles of rs1179251 and HapMap-YRI and HapMap-MKK confirmed by human genome project （HapMap） （P<0.05），but there were no significant differences between genotypes and alleles of rs1179251 and HapMap-HCB，HapMap-JPT，HapMap-GIH population（P>0.05）.Significant differences were observed between genotypes and alleles of rs1179251 and HapMap-YRI and HapMap-MKK confirmed by human genome project （HapMap） （P<0.05），but there were no significant difference between genotypes and alleles of rs1179251 and HapMap-HCB，HapMap-JPT，HapMap-GIH population（P>0.05）.The distribution frequency of each genotype and allele at rs2227485 site was significantly different from HapMap-MKK （P<0.05），but no significant differences were found between the distribution frequency of each genotype and allele at rs2227485 and HapMap-HCB，HapMap-JPT，HapMap-YRI and hapmap-GIH （P>0.05）.Conclusion There were differences in polymorphism of IL-22 （rs1179251 and rs2227485） among different races and regions.

【Key words】interleukin 22;single nucleotide polymorphism;Black-clothes Zhuang;ethnic group

白細胞介素22（interleukin 22，IL-22）屬于白介素10家族的一員，主要由Th22細胞、先天性淋巴細胞、Th17細胞等分泌，具有影響上皮再生、修復(fù)屏障、抗炎、促炎等作用。研究發(fā)現(xiàn)IL-22與自身免疫性疾病[1]、消化系統(tǒng)疾病[2]、腫瘤[3]、哮喘[4]、肺結(jié)核[5]等多種疾病相關(guān)，隨著分子生物學(xué)快速發(fā)展，IL-22基因多態(tài)性與疾病的關(guān)系成為多個領(lǐng)域的研究熱點。目前IL-22基因rs1179251、rs2227485位點在不同種族、地區(qū)之間的差異尚未有報道，因此我們應(yīng)用多重單堿基延伸法（SNaPshot）與DNA測序結(jié)合的方法檢測廣西黑衣壯健康兒童人群這兩個位點的分布情況，并比較與其他種族、地區(qū)、民族的差異情況，為研究IL-22在不同種族及地區(qū)與疾病相關(guān)性研究提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取到我院兒童保健科體檢，臨床指標(biāo)及生長發(fā)育均正常的健康兒童，共115人，男67人，女48人，年齡3～12歲，受試者祖輩三代以上均為廣西黑衣壯，研究對象兒童和（或）監(jiān)護人同意并簽署知情同意書，并通過我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

抽取研究對象2 mL外周靜脈血，存放于EDTA抗凝管中，用離心柱型血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，-80℃保存。

1.2.2 引物的合成

通過primer3在線軟件（http：//primer3.ut.ee/）委托捷瑞生物工程（上海）股份有限公司進行合成，擴增rs1179251位點和rs2227485 位點的引物（見表1）。

1.2.3 PCR擴增

采用15 μL反應(yīng)體系，其中包括2.0 μL模板DNA，10×Buffer 1.5 μL、Mg2+1.5 μL、1 U Taq酶、0.3 μL dNTP、1 μL多重PCR引物，剩余的體積用雙蒸水補足至15 μL，充分混勻，離心，上PCR儀（東勝龍黑金剛EDC-810 PCR儀）。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 2 min;擴增程序： 95℃×3 min，94℃×15 s，55℃×15 s，72℃×30 s（35 cycles）;最后72℃ 延伸3 min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物純化

PCR擴增后取3 μL產(chǎn)物用0.2 μL ExoI（Fermentas公司）和0.8 μL FastAP（Fermentas公司）純化。

1.2.5 延伸反應(yīng)

延伸反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物2 μL，SNaPshot Multiplex kit 1 μL，延伸引物1 μL，水補至6 μL。延伸反應(yīng)程序：96℃×1 min;96℃×10 s，52℃×5 s（30 cycles）;60℃×30 s。

1.2.6 延伸產(chǎn)物

取1 μL加入10 μL buffer，95℃變性3 min，立即冰水浴，上測序儀（ABI3730xl）。單核苷酸多態(tài)性（single nuleotide polymorphism，SNP）分型用GeneMapper 4.1軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，用計數(shù)法直接計算基因型和等位基因頻率，采用Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗群體代表性，基因型頻率和等位基因頻率采用χ2檢驗或Fisher確切概率法作比較，檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 IL-22基因位點rs1179251、rs2227485基因分型

經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗分析，兩位點基因型均符合Hardy-Weinberg平衡，所選人群均具有群體代表性（P>0.05），結(jié)果具有代表性。rs1179251位點存在CC、CG、GG三種基因型，基因型峰型見圖1。rs2227485位點存在AA、AG、GG三種基因型，基因型峰型見圖2。

2.2 IL-22基因rs1179251、rs2227485位點多態(tài)性在廣西黑衣壯兒童中的分布

廣西黑衣壯兒童人群IL-22基因rs1179251的3種基因型CC、CG、GG及等位基因C、G在男女兩組間分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。rs2227485位點的3種基因型AA、AG、GG和等位基因A、G在男女兩組間分布無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.3 兩位點基因型及等位基因在各種族人群間的比較

經(jīng)分析，廣西黑衣壯兒童rs1179251位點各基因型及等位基因的分布頻率與HapMap-YRI、HapMap-MKK均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;與HapMap-HCB、HapMap-JPT、HapMap-GIH相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表4。廣西黑衣壯人群rs2227485各基因型及等位基因分布頻率HapMap-MKK均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與HapMap-HCB、HapMap-JPT、HapMap-YRI、HapMap-GIH相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表5。

3 討論

隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的飛速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)IL-22基因存在多個單核苷酸多態(tài)性位點，且這些位點可能與某些疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。遺傳和環(huán)境的差異可以導(dǎo)致有些疾病的易感性不同，通過對不同種族人群基因多態(tài)性的研究不僅可以進一步了解同一個基因在不同人群中表達的差異及疾病易感性的不同，對疾病的基因診斷及實施個體化的治療方案具有重要意義，而且能豐富我國基因數(shù)據(jù)庫。對健康人群基因多態(tài)性的研究為今后研究疾病與基因多態(tài)性的關(guān)系奠定基礎(chǔ)，進一步揭示人類疾病發(fā)生發(fā)展提供有利條件。

編碼人類IL-22基因位于12號染色體長臂1區(qū)5帶，有6個外顯子5個內(nèi)含子，長度約6 kb，由A、B、C、D、E、F 6個α螺旋結(jié)構(gòu)組成[6]，其受體由IL-22R1和IL-10R2兩個亞基組成，IL-22只有與兩個亞基結(jié)合形成的受體復(fù)合物才有生物活性，才能激活STAT、JAK（Janus激酶）等相關(guān)的信號通路。目前研究發(fā)現(xiàn)IL-22基因多態(tài)性與多種疾病如自身免疫性疾病、肝炎、HIV等相關(guān)，對探索疾病的發(fā)病機制及治療提供新的方向。關(guān)于IL-22基因SNP的研究，AKBARI等[7]發(fā)現(xiàn)高水平的IL-22有助于緩解高血壓和冠心病的病情，rs1179251的G等位基因可能是高血壓和冠心病的保護因子。ZHANG等[3]經(jīng)meta分析表明IL-22基因位點rs1179251多態(tài)性可能是導(dǎo)致癌癥的危險因素之一，而rs2227485與癌癥發(fā)生的風(fēng)險無關(guān)。NIU等[8]研究發(fā)現(xiàn)子癇前期rs2227485位點基因型與對照組有顯著差異，且早發(fā)性子癇前期的等位基因和晚發(fā)性子癇前期的基因型均與對照組有顯著性差異，說明rs2227485位點可能與中國漢族人群子癇前期發(fā)病相關(guān)。FURUSHO等[9]對墨西哥199例潰瘍性結(jié)腸炎和697例健康對照者的IL-22基因的rs2227485位點進行基因分型及統(tǒng)計分析，結(jié)果表明rs2227485位點基因多態(tài)性與潰瘍性結(jié)腸炎及疾病的臨床表現(xiàn)均無相關(guān)性。WANG等[10]研究表明IL-22基因的rs1179251位點的CC基因型與幽門螺桿菌感染相關(guān)，且增加慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生等胃癌前病變風(fēng)險，說明IL-22基因多態(tài)性可能在幽門螺桿菌誘導(dǎo)的胃癌發(fā)生中起關(guān)鍵作用。QIN等人[11]應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)和DNA測序的方法進行分析，發(fā)現(xiàn)IL-22基因rs1179251位點的多態(tài)性與胃癌和胃癌晚期及轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。LIAO等[12]對IL-22基因的rs2227485進行基因分型檢測，發(fā)現(xiàn)rs2227485位點C等位基因與胃黏膜相關(guān)組織淋巴瘤的易感性具有較高的相關(guān)性。同一基因位點在不同疾病不同地域人種中的研究結(jié)果不盡相同，這可能與不同地域及人種的生活環(huán)境、氣候等各個方面差異以及個體之間的差異有關(guān)，因此，進一步研究不同人種及不同地域人群的基因多態(tài)性分布非常重要。為深入研究疾病與相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)，我們課題組主要研究廣西黑衣壯哮喘兒童相關(guān)基因的篩查，前期研究了IL-33基因rs4740840G/A、rs16924159G/A多態(tài)性在廣西黑衣壯兒童的分布特點[13]，而至今尚未發(fā)現(xiàn)IL-22基因rs1179251、rs2227485位點與哮喘相關(guān)性研究的報道，因此研究IL-22基因rs1179251、rs2227485位點在廣西黑衣壯健康兒童的分布特點，可為今后研究這兩個位點分布特點與廣西黑衣壯哮喘兒童的相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ)。

壯族是我國最大的一個少數(shù)民族，主要集中分布在地處中國西南邊疆的廣西，而黑衣壯是壯族的一個支系，主要聚居在廣西那坡縣境內(nèi)。從我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，廣西黑衣壯兒童人群中IL-22基因rs1179251以基因型CC（46.09%）、CG（46.09%）和等位基因C（71.64%）多見，rs2227485以基因型 AG（57.39%）和等位基因A（54.48%）多見，rs1179251、rs2227485兩位點的基因型及等位基因頻率在男女性別分布比較均無顯著差異，提示性別可能對IL-22基因多態(tài)性的分布影響不大。此外，我們將廣西黑衣壯兒童人群與國際人類基因組單體型圖計劃公布的HapMap-HCB、HapMap-JPT、HapMap-YRI、HapMap-GIH、HapMap-MKK的數(shù)據(jù)比較，發(fā)現(xiàn)廣西黑衣壯兒童rs1179251位點各基因型及等位基因的分布頻率與HapMap-YRI、HapMap-MKK均有顯著差異;與HapMap-HCB、HapMap-JPT、HapMap-GIH相比差異不大。rs2227485位點各基因型及等位基因分布頻率與HapMap-MKK均有顯著差異，與HapMap-HCB、HapMap-JPT、HapMap-YRI、HapMap-GIH相比差異不大。廣西黑衣壯人、HapMap-HCB、HapMap-JPT、HapMap-YRI、HapMap-GIH、HapMap-MKK為不同種族不同膚色的人群，地域環(huán)境差異大，親緣關(guān)系遠，基因多態(tài)性分布差異大，結(jié)果表明IL-22這兩位點存在較強的種族性差異和地域性差異，同時也體現(xiàn)出基因多態(tài)性分布特點與種族差異、地域差異相關(guān)，也可能與不同的生活環(huán)境、氣候、飲食等相關(guān)。本研究主要針對廣西黑衣壯兒童進行SNP多態(tài)性與不同地域、種族進行比較，因不同地域人群遺傳存在差異，可能造成了研究結(jié)果的不同。我們首次報道了廣西黑衣壯兒童IL-22基因rs1179251、rs2227485兩位點各基因型和等位基因分布特點，這不僅為IL-22基因多態(tài)性在人類疾病中的研究打下基礎(chǔ)，也為豐富我國地區(qū)及基因掃描貢獻綿薄之力。同時我們的研究也存在不足，由于樣本量較少，仍需要擴大樣本量進一步證實，其次，我們的研究結(jié)果僅具有區(qū)域代表性，今后我們將進一步研究IL-22基因多態(tài)性在不同民族、地區(qū)人群中對疾病的影響。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2019-10-10 修回日期：2019-12-24）

（編輯：潘明志）

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81360003）

作者簡介：梁立婷，女，在讀碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：小兒呼吸、免疫性疾病。E-mail：398413299@qq.com

通信作者：林娜。E-mail：linna7766328@163.com

[本文引用格式]梁立婷，陸壯念，楊麗娟，等.廣西黑衣壯兒童IL-22 基因rs1179251、rs2227485位點多態(tài)性研究[J].右江醫(yī)學(xué)，2020，48（3）：194-199.