闞寵　黎建昌　黃小程　陳福禹　方東　傅后杰　盧東軍　陳耀林　倪安妮　李根亮

【摘要】目的 探討外泌體相關(guān)跨膜蛋白基因在肝細(xì)胞癌（HCC）中的作用及可能的作用機(jī)制。方法 以癌癥來源外泌體相關(guān)跨膜蛋白基因?yàn)楸尘?，以模型小鼠HCC組織和健康肝組織為材料，以RNA-seq和生物信息學(xué)作為分析手段進(jìn)行研究。結(jié)果 于HCC中發(fā)現(xiàn)138個(gè)差異表達(dá)的外泌體跨膜蛋白基因，它們共參與11個(gè)生物學(xué)程序、28個(gè)細(xì)胞組分、9個(gè)分子功能、1個(gè)信號(hào)通路和5個(gè)編碼蛋白序列特征。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些基因編碼的蛋白多數(shù)含有拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域，主要參與細(xì)胞遷移、整合素信號(hào)通路、細(xì)胞粘連及癌癥蛋白聚糖信號(hào)通路，而且一些外泌體來源跨膜蛋白還具有蛋白結(jié)合、鈣離子結(jié)合及轉(zhuǎn)移酶活性等分子功能。結(jié)論 HCC中外泌體相關(guān)跨膜蛋白主要在細(xì)胞膜表面通過上調(diào)整合素和癌癥蛋白聚糖途徑，以蛋白結(jié)合、鈣離子結(jié)合及轉(zhuǎn)移酶活性等分子功能影響細(xì)胞粘連，促進(jìn)HCC中的細(xì)胞遷移。

【關(guān)鍵詞】肝細(xì)胞癌;外泌體;跨膜蛋白;整合素;細(xì)胞遷移

中圖分類號(hào)：R735.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.03.006

Downregulation of exosome-associated transmembrane proteins inhibits liver cancer cell migration

KAN Chong1，LI Jianchang1，HUANG Xiaocheng1，CHEN Fuyu1，F(xiàn)ANG Dong1，F(xiàn)U Houjie1，LU Dongjun1，CHEN Yaolin2，NI Anni3，LI Genliang4

（Youjiang Medical University for Nationalities 1.2016 Undergraduate in Clinical Medicine，2.2015 Undergraduate in Clinical Medicine，3.Graduate School，4.Department of Biochemistry and Cell Molecular Biology，School of Basic Medical Sciences，Baise 533000，Guangxi China）

【Abstract】Objective The purpose of this study was to investigate the role of exosome related transmembrane protein genes in hepatocellular carcinoma （HCC） and the possible mechanism.Methods The background of cancer derived exosomes related transmembrane protein genes was studied.HCC tissues from mouse model and healthy liver were used as materials.And RNA-seq and bioinformatics were used as analytical methods.Results There were 138 differentially expressed transmembrane protein genes in HCC.These genes participated in 11 biological processes;formed 28 cell components，9 molecular functions，1 KEGG pathway and 5 UP_seq feature.Further analysis showed that most of the proteins encoded by these genes contain topological domains，which were mainly involved in cell migration，integrin signaling pathways，cell adhesions and proteoglycan signaling pathways in cancer，and some exosomal transmembrane proteins had protein binding，calcium ion binding，and transferase activity.Conclusion Exosome related transmembrane proteins in HCC? mainly regulate the syntaxin and cancer proteoglycan pathways on the surface of cell membrane.The molecular functions of protein binding，calcium binding and transferase activity affect cell adhesion and promote cell migration in HCC.

【Key words】hepatocellular carcinoma;exosomes;transmembrane proteins;integrin;cell migration

1983年，約翰斯通初次在綿羊的網(wǎng)織紅細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了外泌體。它可由不同細(xì)胞產(chǎn)生并釋放[1]。并且經(jīng)由細(xì)胞分泌的外泌體含有不同的生物學(xué)功能，如增殖分化、細(xì)胞遷移、介導(dǎo)細(xì)胞間物質(zhì)傳遞及交流等。腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體可促進(jìn)癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移[2]，但也有的能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)育[3]。外泌體內(nèi)也存在一些相關(guān)跨膜蛋白，它們也能夠影響腫瘤細(xì)胞的黏附、分化、遷移及侵襲[4～5]。但腫瘤來源的外泌體相關(guān)跨膜蛋白參與完成這些功能的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的肝細(xì)胞癌（HCC）模型小鼠的瘤體組織和健康對(duì)照小鼠的肝組織進(jìn)行RNA-seq，從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載腫瘤來源外泌體相關(guān)跨膜蛋白基因，構(gòu)建比對(duì)數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用生物信息學(xué)手段，篩選瘤體組織中差異表達(dá)的外泌體相關(guān)跨膜蛋白基因，再通過功能富集獲得外泌體相關(guān)跨膜蛋白基因（exosome-associated transmembrane proteins-encoding genes，ETPGs）在癌組織中的作用，探討ETPGs在HCC中可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 肝癌小鼠模型的構(gòu)建和RNA-seq

7周齡健康昆明小鼠100只購自右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。參照前期實(shí)驗(yàn)的方法[6]，50只通過雙前肢腋下注射H22肝癌細(xì)胞株構(gòu)建肝細(xì)胞癌小鼠模型，另50只同法注射不含H22的生理鹽水作對(duì)照。正常飼養(yǎng)4周后，取瘤體組織和對(duì)照組小鼠肝組織，以RNA提取試劑盒（Invitrogen，中國上海）提取總RNA（n=50），同組內(nèi)總RNA樣本等量混合用于RNA-seq[6]。生物信息學(xué)分析HCC中的差異表達(dá)基因，基因表達(dá)以每百萬測(cè)序堿基中每千個(gè)轉(zhuǎn)錄子測(cè)序堿基中所包含的測(cè)序片斷數(shù)（expected number of fragments per kilobase of transcript sequence per millions base pairs sequenced，F(xiàn)PKM）表示。

1.2 ETPGs的篩選

從NCBI的nucleotide數(shù)據(jù)庫下載癌癥來源的外泌體相關(guān)跨膜蛋白基因，構(gòu)建基因比對(duì)數(shù)據(jù)庫。以差異表達(dá)基因與構(gòu)建的基因比對(duì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，獲得HCC中差異表達(dá)的ETPGs（differentially expressed ETPGs，DEEs）。其中以FPKM比值≥2或≤0.5，且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）≤0.05的基因?yàn)镈EEs。

1.3 DEEs的功能分析

通過DAVID在線軟件（https：//david.ncifcrf.gov），對(duì)以上獲得的DEEs進(jìn)行功能富集，對(duì)富集到的各功能進(jìn)行功能注釋聚類，其中以FDR≤0.05的為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 DEEs編碼蛋白的互作分析

通過STRING 11.0版本軟件（https：//string-db.org/）在線對(duì)DEEs編碼蛋白進(jìn)行互作分析，以此評(píng)價(jià)HCC中DEEs編碼蛋白在分布和功能上的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 篩選出的DEEs

通過比對(duì)分析，我們共篩選出138個(gè)DEEs。見表1。

2.2 篩選出的DEEs的功能

對(duì)篩選出的DEEs經(jīng)功能富集分析，結(jié)果顯示共富集到11個(gè)生物學(xué)程序（biological process，BP）、28個(gè)細(xì)胞組分（cellular component，CC）、9個(gè)分子功能（molecular function，MF）、1個(gè)信號(hào)通路（KEGG pathway，KP）和5個(gè)編碼蛋白序列特征（UP_seq feature，US），見圖2、圖3。從28個(gè)CC可以看出，大量跨膜蛋白相關(guān)基因編碼蛋白分布于胞膜區(qū)域和細(xì)胞連接部分。而從11個(gè)BP可以看出，這些基因編碼跨膜蛋白參與的生物學(xué)過程，是細(xì)胞粘連（14個(gè)基因）、整合素信號(hào)通路（6個(gè)基因）、細(xì)胞遷移調(diào)控（7個(gè)基因）等。9個(gè)MF顯示這些基因編碼蛋白主要具有蛋白結(jié)合、鈣離子結(jié)合及轉(zhuǎn)移酶活性等功能。1條信號(hào)通路則是癌癥中的蛋白聚糖信號(hào)途徑（8個(gè)基因）。HCC中相關(guān)基因編碼蛋白的互作見圖4。

3 討論

研究證實(shí)，跨膜蛋白在腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移中扮演重要角色[7]。我們通過對(duì)HCC中DEEs的分析，發(fā)現(xiàn)在HCC中存在138個(gè)相關(guān)差異表達(dá)基因。功能富集結(jié)果顯示，這些DEEs共參與11個(gè)BP、28個(gè)CC、9個(gè)MF、1個(gè)KP和5個(gè)US。它們的生理功能主要集中在細(xì)胞遷移的調(diào)控、整合素信號(hào)通路和細(xì)胞粘連，在細(xì)胞連接和細(xì)胞膜處發(fā)揮作用。

整合素家族作為細(xì)胞黏附分子中的一類，是連接細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）相互作用的一種細(xì)胞表面糖蛋白受體，在肝癌黏附轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[8]。整合素可以介導(dǎo)低剪切力以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的遷移[9]，而IL-8可上調(diào)整合素α亞基的表達(dá)，但各亞基具有濃度性差異，其調(diào)控作用可能具有差異性，但確實(shí)可以促進(jìn)癌細(xì)胞遷移[10]。反義整合素αV、β3基因治療對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，聯(lián)合應(yīng)用整合素αVβ3反義基因治療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用更為顯著[11]，在Hep3B細(xì)胞中消減整合素α7（ITGA7）的表達(dá)，能明顯抑制細(xì)胞克隆形成和細(xì)胞遷移[12]。整合素表達(dá)的減少有可能抑制肝癌的發(fā)生、發(fā)展[13]。我們的研究結(jié)果表明，整合素在參與肝癌的發(fā)生發(fā)展等過程中，可能能夠通過上調(diào)表達(dá)來促進(jìn)腫瘤遷移。在我們的研究中，外泌體相關(guān)跨膜蛋白基因中也出現(xiàn)了四跨膜蛋白家族等跨膜蛋白基因。整合素和生長(zhǎng)因子、蛋白酶等可組成跨膜蛋白網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞黏附、遷移、增殖、分化等生理過程[14～15]。我們發(fā)現(xiàn)，在HCC中，與整合素相關(guān)的多種基因表達(dá)上調(diào)，表明HCC癌組織細(xì)胞膜中整合素可能被激活表達(dá)，以達(dá)到促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移的目的。這些跨膜蛋白具有蛋白結(jié)合、鈣離子結(jié)合及轉(zhuǎn)移酶活性等分子功能，表明其發(fā)揮作用主要是通過這些方式實(shí)現(xiàn)的。KEGG分析表明，整合素和跨膜蛋白相關(guān)基因也參與以上GO功能相關(guān)的1個(gè)信號(hào)通路，即癌癥蛋白聚糖信號(hào)途徑。這些結(jié)果表明，在HCC中，多種相關(guān)基因出現(xiàn)異常表達(dá)，并參與蛋白聚糖信號(hào)途徑。說明整合素等跨膜蛋白的表達(dá)上調(diào)通過蛋白聚糖信號(hào)途徑發(fā)揮著極其重要的作用。本研究中差異表達(dá)基因的編碼蛋白的互作分析同樣說明了這些基因功能的相關(guān)性。

綜上所述，在HCC中共有138個(gè)DEEs，其功能主要集中在細(xì)胞粘連、整合素信號(hào)通路、細(xì)胞遷移調(diào)控、癌癥蛋白聚糖信號(hào)通路等方面。HCC中外泌體相關(guān)跨膜蛋白可能利用上調(diào)整合素，以蛋白結(jié)合、鈣離子結(jié)合及轉(zhuǎn)移酶活性的方式，通過細(xì)胞黏附，以癌癥中的蛋白聚糖信號(hào)途徑促進(jìn)HCC中細(xì)胞的遷移。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-11-27 修回日期：2020-02-06）

（編輯：梁明佩）

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金（2016GXNSFAA380177，2015 GXNSFAA139219）;廣西壯族自治區(qū)級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201810599046，201810599039）;右江民族醫(yī)學(xué)院校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201810599113）

作者簡(jiǎn)介：闞寵，男，醫(yī)學(xué)本科在讀。E-mail：3491797385@qq.com

通信作者：李根亮。E-mail：ligenliang@163.com

[本文引用格式]闞寵，黎建昌，黃小程，等.外泌體相關(guān)跨膜蛋白上調(diào)整合素促進(jìn)HCC中細(xì)胞遷移的研究[J].右江醫(yī)學(xué)，2020，48（3）：188-193.