田東芳，崔香玲，周睿，張永欣，馬雪梅，岑山

·論著·

CRISPR系統(tǒng)相關(guān)蛋白的純化與活性分析

田東芳，崔香玲，周睿，張永欣，馬雪梅，岑山

100124 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院（田東芳、馬雪梅）；100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所免疫室（田東芳、崔香玲、周睿、張永欣、岑山）

對(duì) CRISPR 相關(guān)蛋白 Cas3、Cas6 及 Cas9 進(jìn)行表達(dá)純化，并測(cè)定其活性。

在體外構(gòu)建帶有目的基因的質(zhì)粒，導(dǎo)入大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，通過大腸桿菌的過表達(dá)，裂解并提取蛋白，利用 His 標(biāo)簽，可將目的蛋白純化出來；通過 3 種 Cas 蛋白對(duì)不同核酸的切割，分別設(shè)計(jì) 3 種核酸底物，再通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，最終確定 Cas 蛋白的活性。

成功表達(dá)并純化得到 Cas3、Cas6 及 Cas9 3 種蛋白，并根據(jù)其蛋白特性，與相應(yīng)的核酸底物進(jìn)行孵育，在電泳后通過凝膠成像，可觀察到 3 種蛋白均具有活性。

表達(dá)純化的 Cas3、Cas6 及 Cas9 具有生物學(xué)功能，為其功能機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

CRISPR； Cas3； Cas6； Cas9

規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列及相關(guān)蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated proteins，CRISPR-Cas）是細(xì)菌和古生菌用來抵抗外源核酸的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[1]。CRISPR 位點(diǎn)是由細(xì)菌自身的重復(fù)序列及用于識(shí)別外源核酸的間隔序列組成。CRISPR 免疫系統(tǒng)執(zhí)行功能，需要經(jīng)歷 3 個(gè)階段：適應(yīng)、表達(dá)及干擾。在適應(yīng)階段，細(xì)菌將來源于噬菌體或者外源質(zhì)粒的核酸序列作為間隔序列，整合到 CRISPR 位點(diǎn)的重復(fù)序列之間。這些間隔序列執(zhí)行序列記憶功能，以保證在之后的相應(yīng)噬菌體或質(zhì)粒的入侵過程中進(jìn)行針對(duì)性的防御[2]。在表達(dá)階段，所有重復(fù)序列和間隔序列作為一個(gè)整體，被轉(zhuǎn)錄成 crRNA 前體，最終被相應(yīng) Cas 蛋白處理成成熟的 crRNA[3]。在干擾階段，crRNA 作為向?qū)Вc入侵的核酸互補(bǔ)配對(duì)，同時(shí)由相應(yīng)的 Cas 蛋白進(jìn)行識(shí)別以及切割外源入侵核酸[4]。

根據(jù)基因組成、Cas 蛋白與基因結(jié)構(gòu)之間的序列相似性，目前將 CRISPR 系統(tǒng)分為兩類（1 類和 2 類），其中 1 類中包含 3 種型別（I 型、III 型和 IV 型），2 類中也包含 3 種型別（II 型、V 型和 VI 型）以及 19 個(gè)亞型[5]。兩類 CRISPR-Cas系統(tǒng)在執(zhí)行功能的效應(yīng)蛋白上有根本的不同，1 類 CRISPR 系統(tǒng)是由 4 ~ 7 個(gè) Cas 蛋白組成的多亞基效應(yīng)復(fù)合物[6]；2 類 CRISPR 系統(tǒng)是較為不常見的，幾乎完全局限于細(xì)菌，由單一的大蛋白構(gòu)成效應(yīng)器[7]。I 型系統(tǒng)是最普遍的系統(tǒng)，包含 7 個(gè)亞型，都是依賴于多亞基效應(yīng)復(fù)合物來靶向切割目標(biāo)序列。其中，Cas3 蛋白是一種用于降解外源核酸的核酸內(nèi)切酶[8-9]，Cas6 是將長(zhǎng)鏈的 crRNA 前體切割成成熟的 crRNA 的核酸內(nèi)切酶[10-11]。在 II 型系統(tǒng)中，最普遍也是研究最多的就是 Cas9 蛋白，包含 HNH 和 RuvC 兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別降解目標(biāo) DNA 的互補(bǔ)鏈和非互補(bǔ)鏈[12-14]。

CRISPR 系統(tǒng)作為一種基因編輯工具，憑借設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、效率高的優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用發(fā)展已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)，并在分子生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。目前基于 CRISPR 系統(tǒng)發(fā)展而來的應(yīng)用工具，已經(jīng)成功地作用于各種體外培養(yǎng)的細(xì)胞，通過對(duì)胚胎細(xì)胞的編輯而產(chǎn)生動(dòng)物模型的技術(shù)也在不斷成熟，以及在疾病治療特別是遺傳病治療中也展現(xiàn)出其獨(dú)有的優(yōu)勢(shì)，并且其作用范圍在不斷的擴(kuò)展，作用方式還在不斷的創(chuàng)新。CRISPR 系統(tǒng)雖然已在多個(gè)領(lǐng)域有所應(yīng)用，但也只是利用了其一點(diǎn)價(jià)值，更多的價(jià)值正期待著我們?nèi)ラ_發(fā)利用。

本研究中，選用了來源于 I-F 型的綠膿桿菌的 Cas3（Genebank：KYO77788.1）和 Cas6（Genebank：KYO77784.1）蛋白，以及來源于 II-A 型的化膿鏈球菌的 Cas9（Genebank：AII16589.1）蛋白。對(duì)其蛋白進(jìn)行了重組表達(dá)以及純化，并證明了所純化蛋白的生物學(xué)活性，為其功能機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

基因3、6 和9 由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；HisTrap HP 1 ml 預(yù)裝柱購自美國 GE Healthcare 公司；腸激酶購自于美國 NEB 公司；分子伴侶質(zhì)粒和 BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自于日本 Takara 公司；T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自于美國 Invitrogen 公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蛋白表達(dá) 將合成得到的3、6 以及9 基因分別進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，將目的基因克隆到 pET32a 表達(dá)載體上，提取質(zhì)粒，并將帶有目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)體系中。

1.2.1.1 Cas3 先在大腸桿菌 BL21（DE3）中，轉(zhuǎn)進(jìn) pKJE7 分子伴侶質(zhì)粒，再將帶有分子伴侶的菌株制備成感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)入帶有目的基因的質(zhì)粒。取帶有兩種質(zhì)粒的單克隆菌落，過夜培養(yǎng)成母種，按照 1:100 轉(zhuǎn)接比例，37 ℃孵育菌液濃度至600約為 0.5，并在轉(zhuǎn)接時(shí)加入 2 mg/ml 的阿拉伯糖，用以誘導(dǎo)分子伴侶蛋白的表達(dá)。當(dāng)菌液到達(dá)指定濃度時(shí)，加入 0.5 mmol/L IPTG，18 ℃過夜誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.1.2 Cas6 和 Cas9 取單克隆菌落過夜培養(yǎng)成母種，按照 1:100 轉(zhuǎn)接比例，37 ℃孵育菌液濃度至600約為 0.5 時(shí)，加入 0.5 mmol/L IPTG，18 ℃過夜誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.1.3 純化與透析 取 1 L 過夜培養(yǎng)的菌液離心，用 20 mmol/L HEPES，500 mmol/L NaCl 和1 mmol/L TCEP 重懸并超聲，過鎳柱分離純化，在透析過程中加入腸激酶用于切除 Trx 促溶標(biāo)簽。

1.2.2 酶活驗(yàn)證

1.2.2.1 Cas3 配制10倍反應(yīng)液：200 mmol/L Tris，3 mol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2；將兩條單鏈 DNA 退火成雙鏈 DNA（5' GCTGTACGTCACT ATCGAAGCAATACAGGTAGACGCGGACATCAAGCCCGCCGTGAAGGTGCAGCTTCTCTACAGAGTGC 3'；5' GCACTCTGTAGAGAAGCTGCACCAA GTGCCGCCGCTTGATGTCCGCGTCTACCTGTATTGCTTCGATAGTGACGTACAGC 3'），中間包含 10 bp 不互補(bǔ)區(qū)域；分別取 1 μl 反應(yīng)液，1 μl Cas3 蛋白酶和 1 μl dsDNA，最終用 H2O 補(bǔ)足至 10 μl；37 ℃水浴，分別取30、60、90、120 和 150 min 時(shí)間節(jié)點(diǎn)；反應(yīng)結(jié)束后用質(zhì)粒提取試劑盒將 DNA 提取出來，上樣于 20% 聚丙烯酰胺凝膠，120 V 電泳 1 h；電泳結(jié)束后用 SYBR Gold 染色 20 min，最終用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè) dsDNA 的切割情況。

1.2.2.2 Cas6 配制 10倍反應(yīng)液：200 mmol/L HEPES，1 mol/L KCl；反應(yīng)體系：1 μl（10 μmol/L）RNA（5' CUGCCGUAUAGGCAGC 3'），1 μl Cas6 蛋白酶和 1 μl 反應(yīng)溶液，最終用 H2O 補(bǔ)足至10 μl；將上述溶液混合后，于 25 ℃反應(yīng) 5 min，加入50 μl Trizol，10 μl 氯仿，劇烈振蕩30 s，4 ℃離心后取上層水相加入 50 μl 異丙醇，室溫靜止10 min，并再次 4 ℃離心 10 min。棄上清加入50 μl 現(xiàn)配 75% 乙醇，離心后棄上清，充分晾干后，加入 10 μl 水，上樣至尿素變性膠，先用 200 V 電泳 30 min，隨后調(diào)整電壓 400 V 電泳約 2.5 h。電泳結(jié)束后，用 SYBR Gold 染色 20 min，最后用凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.2.2.3 Cas9 配制 10 倍反應(yīng)液：200 mmol/L HEPES，pH 7.5；20 mmol/L MaCl2；1 mol/L KCl；底物 DNA（5' TCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTA CGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCAATCCCAGCCAAGCGCACCTAATTTCCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAA 3'）濃度為80 ng/μl；sgRNA（5' GGAAAUUAGGUGCGCUUGGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUU 3'）的濃度600 ng/μl；加入 1 μl 反應(yīng)液，1 μl Cas9 蛋白酶，1 μl dsDNA 和 1 μl sgRNA，用 H2O 補(bǔ)足至 10 μl，37 ℃孵育 15 min，反應(yīng)結(jié)束后，用聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)，120 V 電泳 40 min，然后用 SYBR Gold 染色 20 min后，用凝膠成像系統(tǒng)成像。

2 結(jié)果

2.1 蛋白的表達(dá)與純化

Cas3 蛋白來源于綠膿桿菌，由 3231 bp 基因編碼，包含 1076 個(gè)氨基酸殘基，分子量約為121 kD。為了提高 Cas3 蛋白的溶解性，在表達(dá)體系中又轉(zhuǎn)入了表達(dá)K-J-E 伴侶蛋白質(zhì)的 pKJE7 分子伴侶質(zhì)粒。首先加入阿拉伯糖誘導(dǎo)2.5 h 左右，誘導(dǎo)伴侶蛋白表達(dá)，之后再加入 IPTG 誘導(dǎo)目的蛋白，促進(jìn)目的蛋白的溶解。過夜誘導(dǎo)約 18 h 后，收集菌體，進(jìn)行蛋白純化。pET32a 表達(dá)載體中帶有腸激酶、凝血酶的酶切位點(diǎn)，因?yàn)?pET32a 帶有約 18 kD 標(biāo)簽，標(biāo)簽的存在會(huì)影響酶活性，所以在透析時(shí)加入了腸激酶以切除標(biāo)簽（圖 1A）。

Cas6 蛋白與 Cas3 蛋白一樣也來源于綠膿桿菌，又稱為 Csy4 蛋白，由 564 bp 基因編碼，包含 187 個(gè)氨基酸殘基，分子量約為 22 kD。同樣在透析時(shí)加入腸激酶以切除標(biāo)簽，切除 Trx 標(biāo)簽后，由于融合蛋白的 C 端依然攜帶 His 標(biāo)簽，且融合蛋白與腸激酶位點(diǎn)之間存在載體序列所表達(dá)的蛋白，所以切割標(biāo)簽后的蛋白大小約為 25 kD（圖 1B）。

Cas9 蛋白來源于化膿鏈球菌，是基因編輯中應(yīng)用最廣的蛋白。由 4107 bp 基因編碼，包含 1368 個(gè)氨基酸殘基，分子量約為 158 kD。目的蛋白能夠在大腸桿菌中大量表達(dá)，且溶解性較好。在透析時(shí)加入腸激酶以切除標(biāo)簽（圖 1C）。

2.2 濃度測(cè)定

在富集培養(yǎng)后，1 L菌液被濃縮至 30 ml 粗蛋白提取物，上至 HiTrap HP 柱，得到 3 種蛋白的濃度分別為 1.3、1.8 和 2.3 mg/ml（圖 2）。通過 Quantity One 軟件進(jìn)行 SDS-PAGE灰度分析，其中目的條帶所占信號(hào)值分別為 110.27、124.67 和 91.48，目的條帶所在泳道所有信號(hào)值之和分別為 138.48、142.03 和 113.60，最終計(jì)算得到每種蛋白的純度分別約為 80%、88% 和 81%。

2.3 Cas3 酶活驗(yàn)證

Cas3 能夠在不改變自身構(gòu)象的情況下，切割雙鏈 DNA。有研究表明，crRNA 與 4 種相關(guān)蛋白組成了 Csy 復(fù)合物，它能夠識(shí)別外源核酸，并將外源核酸進(jìn)行解鏈，使之形成 R 環(huán)結(jié)構(gòu)，Cas3 識(shí)別該 R 環(huán)結(jié)構(gòu)并將其切割。根據(jù)文獻(xiàn)[15]的方法，在 80 bp 底物中間，人為設(shè)計(jì) 10 bp 不互補(bǔ)區(qū)域，Cas3 能夠識(shí)別該結(jié)構(gòu)并切割（圖 3A）。在37 ℃條件下，選取 30、60、90、120 和 150 min 5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，切割產(chǎn)物逐漸增多（圖 3B）。

2.4 Cas6 酶活驗(yàn)證

Cas6 是 RNA 內(nèi)切酶，在表達(dá)階段，它能夠識(shí)別 CRISPR 位點(diǎn)中的重復(fù)序列，并在重復(fù)序列的下游將間隔序列切開，根據(jù)文獻(xiàn)[10]的方法，我們選取了 16 nt 帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的 RNA，并且下游包含 1 nt 的間隔序列堿基，當(dāng) Cas6 加入進(jìn)去之后，能夠立即切掉末端的間隔序列（圖 4A）。在室溫條件下，將底物與酶反應(yīng) 5 min 后即可清晰地看到切割條帶（圖 4B）。

1：全菌；2：純化；3：切割

Figure 1 Protein purification and cutting labels (A: Cas3; B: Cas6; C: Cas9)

圖 2 蛋白濃度計(jì)算（A：Cas3；B：Cas6；C：Cas9）

Figure 2 Concentration of protein (A: Cas3; B: Cas6; C: Cas9)

圖 3 Cas3 的酶活驗(yàn)證（A：Cas3 切割核酸底物原理圖；B：隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，dsDNA 底物被切割，且切割產(chǎn)物有更多的積累）

Figure 3 Assay of Cas3 activity (A:Schematic diagram of Cas3 cutting nucleic acid substrate; B: With the extension of the reaction time, the dsDNA substrate is cleaved, and the cleaved products have more accumulation)

圖 4 Cas6 的酶活驗(yàn)證（A：Cas6 切割核酸底物原理圖；B：隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，可明顯觀察到 RNA 底物被切割）

Figure 4 Assay of Cas6 activity (A: Schematic diagram of Cas6 cutting nucleic acid substrate; B: With increasing reaction time, cleavage of the RNA substrate is clearly observed)

圖 5 Cas9 的酶活驗(yàn)證（A：Cas9 切割核酸底物原理圖；B：沒有 Cas9 加入時(shí)，是沒有切割產(chǎn)物產(chǎn)生的）

Figure 5 Assay of Cas9 activity (A: Schematic diagram of Cas9 cutting nucleic acid substrate; B: When Cas9 is not added, there is no cleavage product)

2.5 Cas9 酶活驗(yàn)證

Cas9 蛋白包含兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，在 sgRNA 的引導(dǎo)下，HNH 結(jié)構(gòu)域切割與 sgRNA 互補(bǔ)的鏈，而RuvC 結(jié)構(gòu)域切割非互補(bǔ)鏈（圖 5A）。根據(jù)文獻(xiàn)[16]，通過體外轉(zhuǎn)錄，得到 sgRNA，PCR 擴(kuò)增出Cas9 切割序列，在 37 ℃條件下切割 15 min，可觀察到被切開的條帶，從而證明了 Cas9 的活性（圖 5B）。

3 討論

自從基因編輯技術(shù)問世以來，CRISPR 系統(tǒng)一直是研究熱點(diǎn)，利用 CRISPR 進(jìn)行基因敲除，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，基因治療等，使 CRISPR 技術(shù)的應(yīng)用越來越廣泛，但目前我們對(duì) CRISPR 系統(tǒng)的了解程度還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，例如發(fā)揮作用所經(jīng)歷的 3 個(gè)階段所涉及到的 Cas 蛋白，我們了解得還是不夠充分。為了對(duì) CRISPR 系統(tǒng)更好地了解，本研究選擇了 I 型的 Cas3 和 Cas6，II 型的 Cas9 作為研究對(duì)象，通過各個(gè)蛋白對(duì)特定核酸底物的切割，證明了 3 種蛋白能夠在體外進(jìn)行切割。本文所應(yīng)用的方法是通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行大量表達(dá)，并通過 His 標(biāo)簽從總蛋白中將目標(biāo)蛋白分離出來。再將目標(biāo)蛋白與核酸底物切割后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，根據(jù)核酸分子量大小，可明確看到核酸是否被切割，從而證明了目標(biāo)蛋白的活性。綜上所述，該工作也為后期的機(jī)制研究以及蛋白之間的相互作用奠定了基礎(chǔ)。

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Purification and activity analysis of proteins related to CRISPR system

TIAN Dong-fang, CUI Xiang-ling, ZHOU Rui, ZHANG Yong-xin, MA Xue-mei, CEN Shan

College of Life Science and Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China (TIAN Dong-fang, MA Xue-mei); Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (TIAN Dong-fang, CUI Xiang-ling, ZHOU Rui, ZHANG Yong-xin, CEN Shan)

To expression and purify CRISPR-related proteins: Cas3, Cas6 and Cas9, and determine their activity to lay the foundation for the subsequent screening of their inhibitors.

The plasmid carrying the target gene was constructed, introduced into anexpression system, and the protein was extracted by over-expression and lysis of, and the target protein was purified by using the His tag; the cleavage of different nucleic acids by the three Cas proteins was performed. Three nucleic acid substrates were designed respectively, and then the activity of Cas protein was finally determined by polyacrylamide gel electrophoresis.

Three proteins, Cas3, Cas6 and Cas9, were successfully expressed and purified, and incubated with the corresponding nucleic acid substrate according to their protein properties. After electrophoresis, gel imaging showed that all three proteins were active.

Three active proteins, Cas3, Cas6 and Cas9, were obtained, which provided the basis for the subsequent screening of anti-CRISPR system.

CRISPR; Cas3; Cas6; Cas9

ZHANG Yong-xin, Email: yongxinzhang@imb.pumc.edu.cn; CEN Shan, Email: shancen@hotmail.com

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（2017-I2M-1-012 YXZ）

張永欣，Email：yongxinzhang@imb.pumc.edu.cn；岑山，Email：shancen@imb.pumc.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.02.011

2019-09-23