劉妍，張小燕，林愛(ài)芬 編譯，胡迅 審校

·新型冠狀病毒專欄·

新型冠狀病毒?。–OVID-19）檢測(cè)加拿大安大略省公共衛(wèi)生局（PHO）實(shí)驗(yàn)室的指導(dǎo)文件

劉妍，張小燕，林愛(ài)芬 編譯，胡迅 審校

100039 北京，解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心臨床研究管理中心（劉妍）；201210 上海，生物芯片上海國(guó)家工程研究中心（張小燕）；317000 臺(tái)州，浙江省臺(tái)州醫(yī)院生物資源中心（林愛(ài)芬）；610041 成都，四川大學(xué)華西醫(yī)院生物樣本庫(kù)（胡迅）

本文提供了 2019 年底中國(guó)湖北省武漢市暴發(fā)的呼吸道疾病相關(guān)的新型冠狀病毒病 19（COVID-19，以前稱之為2019-nCoV）檢測(cè)指南。COVID-19 的病原體是 SARS-CoV-2病毒。為方便交流，PHO 統(tǒng)一使用術(shù)語(yǔ) COVID-19 來(lái)指病毒和疾病。

誰(shuí)負(fù)責(zé)檢測(cè)：

PHO 實(shí)驗(yàn)室將接受符合衛(wèi)生部規(guī)定的受檢對(duì)象（person under investigation，PUI）或疑似病例的樣本檢測(cè) COVID-19。

那些臨床表現(xiàn)不符合病例定義，但被臨床醫(yī)生評(píng)估為存在 COVID-19 風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體也要接受檢測(cè)。PHO 目前不建議對(duì)無(wú)癥狀者進(jìn)行 COVID-19 的常規(guī)檢查。如果臨床醫(yī)生想進(jìn)一步討論檢測(cè)的作用，可隨時(shí)通過(guò) PHO 實(shí)驗(yàn)室的客服中心（416-235-6556/1-877-604-4567）或下班后的緊急值班人員（416-605-3113）電話聯(lián)系 PHO 微生物專家。

檢測(cè)要求必須附帶提供下面 6 條數(shù)據(jù)信息：

為了加快檢測(cè)，自 2020 年 2 月 10 日起，不再需要 PHO 實(shí)驗(yàn)室預(yù)先批準(zhǔn)對(duì) COVID-19 的檢測(cè)，前提是在專門的 PHO COVID-19 檢測(cè)申請(qǐng)中包括以下強(qiáng)制性信息：

1．個(gè)人是否符合新冠病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（是/否）

2．旅行史（國(guó)家和日期）

3．暴露史[接觸了 PUI、病例或疑似病例（是/否），以及任何暴露細(xì)節(jié)]

4．臨床信息（例如發(fā)燒、咳嗽、流鼻涕、肺炎），包括癥狀起病日期

5．樣本類型

6．患者安置情況

標(biāo)本采集建議：

A）未入院的患者（包括急診室患者）

·可接受單個(gè)上呼吸道標(biāo)本進(jìn)行COVID-19 檢測(cè)。

上呼吸道標(biāo)本包括鼻拭子（NPS）或病毒性咽拭子，收集在通用轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)（UTM）中。首選 NPS，因?yàn)楦鶕?jù)目前可獲得的資料，對(duì)于 COVID-19 檢測(cè)，NPS 比咽拭子具有更高的靈敏度。

B）住院患者

對(duì)于住院患者，建議至少?gòu)膬蓚€(gè)不同的部位采集兩個(gè)樣本：

·上呼吸道樣本：送檢 UTM 中收集的 NPS 和病毒性咽拭子。

·下呼吸道標(biāo)本：盡可能送檢。

·痰液：如果患者咳嗽，請(qǐng)收集痰液。但不要誘導(dǎo)。

注意：自 2020 年 3 月 2 日起，將不再對(duì)申請(qǐng) COVID-19 檢測(cè)的標(biāo)本進(jìn)行呼吸道病毒多重 PCR（MRVP）檢測(cè)。只有那些符合 PHO 實(shí)驗(yàn)室接受標(biāo)準(zhǔn)的患者才能做 MRVP 檢測(cè)（如住院暴發(fā)的流行）。有關(guān)更多詳細(xì)信息和接受標(biāo)準(zhǔn)，請(qǐng)參考另一份《呼吸道病毒檢測(cè)信息表》。

COVID-19 的血清學(xué)檢測(cè)目前還無(wú)法開展。

急診檢驗(yàn)樣本（STAT）檢測(cè)要求：

PHO 的實(shí)驗(yàn)室致力于優(yōu)先檢測(cè)原則，以幫助那些醫(yī)療機(jī)構(gòu)在緊急情況下迅速對(duì)患者做出醫(yī)護(hù)決策（急診檢驗(yàn)“STAT”）。

·STAT 樣本必須與常規(guī)樣本分開，單獨(dú)運(yùn)輸?shù)桨泊舐允《鄠惗嗍?661 University Ave. 的運(yùn)輸和接收碼頭，并做好樣本交接。

·STAT 樣本必須放在帶有明顯標(biāo)記的“STAT”包裝中，按照加拿大生物安全標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行處理，并按照《危險(xiǎn)品運(yùn)輸條例》進(jìn)行運(yùn)輸。

·分開運(yùn)輸以免因運(yùn)輸?shù)纫蛩匮诱`檢測(cè)，延誤將把本應(yīng)為急診檢驗(yàn)的樣本作為常規(guī)樣品進(jìn)行處理。

當(dāng)?shù)毓残l(wèi)生部門通知：

所有接受 COVID-19 檢測(cè)的個(gè)人信息都須在當(dāng)?shù)毓残l(wèi)生部門備案。

此文件 2020.03.05 印刷日起生效

樣本采集和處理

樣本申請(qǐng)

檢測(cè)申請(qǐng)申請(qǐng)內(nèi)容樣本類型最小體積采集試劑盒 COVID-19COVID-19 病毒檢測(cè)申請(qǐng)上呼吸道：NPSNPS 放入至少 1.0 mlUTM 中Virus Respiratory Kit #390082 COVID-19COVID-19 病毒檢測(cè)申請(qǐng)上呼吸道：病毒咽拭子（見(jiàn)送檢和采集說(shuō)明）咽拭子放入至少1.0 mlUTM 中Virus Culture Kit #390081 COVID-19COVID-19 病毒檢測(cè)申請(qǐng)下呼吸道（如可能盡量提供）：痰、支氣管肺泡灌洗（BAL）、支氣管沖洗液、胸腔積液、肺組織（見(jiàn)送檢和采集說(shuō)明）1.0 mlTuberculosis Kit #390042

送檢和采集說(shuō)明：

①呼吸道樣本：

A）未入院的患者（包括急診室患者）：可接受單個(gè)上呼吸道標(biāo)本進(jìn)行 COVID-19 檢測(cè)。

上呼吸道標(biāo)本包括 NPS 或病毒性咽拭子，收集在 UTM 中。首選 NPS，因?yàn)楦鶕?jù)目前可獲得的資料，對(duì)于COVID-19 檢測(cè)，NPS 比咽拭子具有更高的靈敏度。

B）住院患者：對(duì)于住院患者，建議至少?gòu)膬蓚€(gè)不同的部位采集兩個(gè)樣本：

·上呼吸道樣本：送檢 UTM 中收集的 NPS 和病毒性咽拭子。

·下呼吸道標(biāo)本：盡可能送檢。

·痰液：如果患者咳嗽，請(qǐng)收集痰液。但不要誘導(dǎo)。

②完成 COVID-19 檢測(cè)申請(qǐng)的所有信息

1．個(gè)人是否符合受檢對(duì)象的標(biāo)準(zhǔn)（是/否）

2．旅行史（國(guó)家和日期）

3．暴露史[接觸了 PUI、確診病例或疑似病例（是/否），以及任何暴露細(xì)節(jié)]

4．臨床信息（例如發(fā)燒、咳嗽、流鼻涕、肺炎），包括癥狀起病日期

5．樣本類型

6．患者安置情況

樣本轉(zhuǎn)運(yùn)前的準(zhǔn)備

樣本放在生物危害標(biāo)記的袋子里密封，樣本采集后應(yīng)儲(chǔ)存在 2 ~ 8 ℃，冰袋轉(zhuǎn)運(yùn)到 PHO 實(shí)驗(yàn)室。如果樣本需要72 小時(shí)以上才能轉(zhuǎn)運(yùn)到檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，則應(yīng)先–80 ℃凍存樣本，然后干冰運(yùn)輸。

臨床樣本運(yùn)送到當(dāng)?shù)?PHO 實(shí)驗(yàn)室的包裝和轉(zhuǎn)運(yùn)，參照《危險(xiǎn)品運(yùn)輸條例》

特殊說(shuō)明：

對(duì)于呼吸道樣本，參考 Virus-Respiratory Kit Instruction Sheet 指示說(shuō)明。

對(duì)痰、BAL、支氣管沖洗液、胸腔積液、肺組織樣本，參見(jiàn) Tuberculosis Kit N-0042。

對(duì)病毒咽拭子樣本，使用 Virus Culture Kit N0081。

申請(qǐng)和試劑盒訂購(gòu)

檢測(cè)申請(qǐng)：需要填寫完成上面概述的用于 COVID-19 檢測(cè)的 6 條信息，提交者（醫(yī)師）和患者信息以及檢測(cè)要求。具體見(jiàn) 2020.03.02 更新版本申請(qǐng)表格。

標(biāo)本容器和用品的申請(qǐng)：請(qǐng)注意，標(biāo)本容器和用品僅提供給送樣者，用于 PHO 測(cè)試的樣本轉(zhuǎn)運(yùn)。見(jiàn) 2017.09.28更新版本申請(qǐng)表格。

檢測(cè)頻率和周轉(zhuǎn)時(shí)間（TAT）

COVID-19 的檢測(cè)要在多倫多 PHO 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。注意：周轉(zhuǎn)時(shí)間依地理位置和距離 PHO 實(shí)驗(yàn)室的遠(yuǎn)近而定。

COVID-19 的檢測(cè)樣本在 PHO 實(shí)驗(yàn)室被確認(rèn)。如果需要額外檢測(cè)，樣本要送到加拿大溫尼伯的國(guó)家微生物實(shí)驗(yàn)室（NML）。

當(dāng)前在PHO實(shí)驗(yàn)室的 COVID-19 檢測(cè)可在 24 小時(shí)內(nèi)完成（從檢測(cè)開始計(jì)算）。

結(jié)果報(bào)告

來(lái)自 PHO 實(shí)驗(yàn)室所有的 COVID-19 最終檢測(cè)結(jié)果要報(bào)告給申請(qǐng)檢測(cè)的醫(yī)生。

作為一種有公共衛(wèi)生意義的疾病，所有陽(yáng)性結(jié)果將被報(bào)告給當(dāng)?shù)毓残l(wèi)生部門。作為臨時(shí)策略，我們也將報(bào)告所有陰性結(jié)果。

檢測(cè)方法

COVID-19 的檢測(cè)流程使用由 PHO 和 NML 實(shí)驗(yàn)室以實(shí)時(shí) RT-PCR 方法共同驗(yàn)證，擴(kuò)增靶基因包括 RNA依賴的 RNA 聚合酶 RdRp 基因和包膜 E 基因。

對(duì)于實(shí)時(shí) PCR 方法只檢測(cè)一個(gè)靶點(diǎn)或有任何靶點(diǎn)不確定的樣本，都將用 PCR 和 Sanger 法對(duì)病毒 RdRp 基因進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)序檢測(cè)。

在 PHO 實(shí)驗(yàn)室，滿足下面兩個(gè)條件可確診為 COVID-19 陽(yáng)性：

1．用實(shí)時(shí) RT-PCR 方法至少檢測(cè)到病毒基因組兩個(gè)靶點(diǎn)。

2．實(shí)時(shí) RT-PCR 檢測(cè)到一個(gè)靶基因，抑或一個(gè)乃至兩個(gè)靶基因都不確定，但經(jīng)測(cè)序可檢測(cè)到 COVID-19 病毒。

如果符合下面幾種情況，PHO 實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果通常被認(rèn)為是不明確。

1．實(shí)時(shí) RT-PCR 只檢測(cè)單個(gè)靶基因。

2．一個(gè)或兩個(gè)靶點(diǎn)的實(shí)時(shí) RT-PCR 結(jié)果都不確定。

3．測(cè)序檢測(cè)不到 COVID-19 病毒。

如果需要，樣本可送 NML 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步檢測(cè)。

關(guān)于 PHO 實(shí)驗(yàn)室 COVID-19 檢測(cè)的實(shí)時(shí) RT-PCR 的更多細(xì)節(jié)可參閱“Diagnostic detection of COVID-19 by real-time RT-PCR”。

關(guān)于 RdRp 基因的 PCR 和測(cè)序的其他技術(shù)信息可參閱“Assays for laboratory confirmation of novel human coronavirus (hCoV-EMC) infections”。

PHO 實(shí)驗(yàn)室已將該檢測(cè)流程修訂為專用于 COVID-19 病毒檢測(cè)。

COVID-19 的血清學(xué)檢測(cè)目前還無(wú)法開展。

總則

COVID-19 的 PHO 檢測(cè)規(guī)則（截止到 2020.02.07）

A．COVID-19 的檢測(cè)

·COVID-19 的檢測(cè)采用的是 PHO 實(shí)驗(yàn)室和 NML 實(shí)驗(yàn)室確定的實(shí)時(shí) RT-PCR 方法。檢測(cè)靶基因包括 RdRp基因和 E 基因。

·實(shí)時(shí) RT-PCR 方法檢測(cè)到兩個(gè)靶基因則實(shí)驗(yàn)室報(bào)告陽(yáng)性。

·實(shí)時(shí) RT-PCR 檢測(cè)到一個(gè)靶基因，或任何一個(gè)靶基因都不確定的樣本，要經(jīng) PCR 擴(kuò)增并用 Sanger 法對(duì)COVID-19 的 RdRp 基因進(jìn)行測(cè)序來(lái)確證。

·如果需要的話，樣本要送到加拿大溫尼伯的 NML做進(jìn)一步檢測(cè)。

B．其他呼吸道病毒的檢測(cè)

·如果患者符合 PHO 實(shí)驗(yàn)室對(duì)此檢測(cè)的接受標(biāo)準(zhǔn)（如住院暴發(fā)的流行），則可以通過(guò) MRVP 檢測(cè)其他呼吸道病毒。進(jìn)一步詳細(xì)信息和納入標(biāo)準(zhǔn)，請(qǐng)參考《呼吸道病毒測(cè)試信息表》。

*基于內(nèi)部實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)和可獲得的序列數(shù)據(jù)信息，上述病毒不會(huì)發(fā)生與 COVID-19 的交叉反應(yīng)。

·如果患者符合此檢測(cè)納入標(biāo)準(zhǔn)，則要申請(qǐng)禽流感病毒檢測(cè)。更多詳細(xì)信息，請(qǐng)參閱《禽流感檢測(cè)信息表》。

注意：如果需要，必須在實(shí)驗(yàn)室申請(qǐng)書上申請(qǐng)其他呼吸道病毒和禽流感的檢測(cè)。

要考慮的其他檢測(cè)----社區(qū)獲得性肺炎病原菌的檢測(cè)

肺炎/肺實(shí)質(zhì)受累的患者也應(yīng)篩查社區(qū)獲得性肺炎的病原菌。PHO 實(shí)驗(yàn)室推薦做如下檢查：

I．肺炎支原體/肺炎衣原體雙鏈 PCR

·相同的鼻拭子和咽拭子樣本應(yīng)該送檢 COVID-19。

II．軍團(tuán)菌檢測(cè)

·軍團(tuán)菌 PCR：同為下呼吸道的樣本（痰、BAL、支氣管沖洗液、氣管吸取物、肺組織）應(yīng)該送檢 COVID-19。

·軍團(tuán)菌尿抗原檢測(cè)：（最少 2 ml 尿量）

說(shuō)明：如果受檢對(duì)象病情不斷惡化或不見(jiàn)好轉(zhuǎn)，應(yīng)該重復(fù)檢測(cè) COVID-19，即使前面其他病原檢測(cè)結(jié)果是陽(yáng)性。

胡迅，Email：hxxhu99@163.com

2020-03-11

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.02.007