張振國(guó)，錢紅，劉克明，羅璋，尤宏?duì)?，郝爽，李楠，馮守明

（1.天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221；2.天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津 300400）

金鱒體色金黃，肉質(zhì)鮮美，具有一定的觀賞價(jià)值，1996 年黑龍江水產(chǎn)研究所從日本引進(jìn)發(fā)眼卵，成功突破了金鱒親魚(yú)育成及人工繁育等技術(shù)[1]，現(xiàn)已成為我國(guó)鱒養(yǎng)殖的重要品種。金鱒屬于冷水性魚(yú)類，最適養(yǎng)殖水溫為12～18℃，主要在東北以及新疆、甘肅、青海等地養(yǎng)殖，北京山區(qū)也有較大規(guī)模的養(yǎng)殖。金鱒的抗病力較強(qiáng)，但隨著金鱒的養(yǎng)殖規(guī)模增加，養(yǎng)殖密度不斷提高，病害也頻繁發(fā)生，尤其是傳染性造血器官壞死病、弧菌病、細(xì)菌性鰓病、細(xì)菌性腎病、水霉病和小瓜蟲(chóng)等疾病[2,3]。長(zhǎng)期以來(lái)魚(yú)病防治主要還是使用抗生素和化學(xué)藥物，藥物殘留和食品安全問(wèn)題日益嚴(yán)峻。目前免疫增強(qiáng)劑的研究應(yīng)用較多，但多見(jiàn)于單一的種類，復(fù)合免疫制劑研究較少，僅有其對(duì)凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus vannamei[4]、刺參Apostichopus japonicus[5]、德國(guó)鏡鯉Cyprinus carpio specularis[6]以及大菱鲆Scophthalmus maximus和血鸚鵡Cichlasoma var.[7]的非特性免疫力的研究。

本實(shí)驗(yàn)中使用的復(fù)合免疫增強(qiáng)劑主要成分是酵母多糖、大黃、黃芩、黃柏以及維生素類，經(jīng)過(guò)科學(xué)合理的比例配制而成，具有無(wú)毒無(wú)害無(wú)藥物殘留的優(yōu)點(diǎn)。復(fù)合免疫增強(qiáng)劑首次在冷水魚(yú)上研究應(yīng)用，對(duì)冷水魚(yú)養(yǎng)殖中細(xì)菌病預(yù)防具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)金鱒體質(zhì)量為（98.6±5.3）g，采自北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所延慶冷水魚(yú)基地。養(yǎng)殖試驗(yàn)在天津市水產(chǎn)研究所循環(huán)水系統(tǒng)中進(jìn)行，每個(gè)水族缸里飼養(yǎng)36 尾，水溫控制在（13±1）℃，溶氧保持在9.0 mg/L 以上，pH7.5 左右，氨氮濃度小于0.01mg/L。每天9:00 和16:00 投喂兩次飼料，馴化1 周正常攝食后開(kāi)展試驗(yàn)。

1.2 方法

試驗(yàn)分3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，在基部飼料中分別添加0.5%、1%和2%復(fù)合免疫增強(qiáng)劑和1 個(gè)不添加復(fù)合免疫增強(qiáng)劑的對(duì)照組，每組36 尾魚(yú)。試驗(yàn)開(kāi)始后第1、2、3 周和第4 周采血，每組采4 尾魚(yú)，采血部位為尾靜脈，血液4℃過(guò)夜，3000r/min 離心后取上清，收集血清，采用上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司的試劑盒測(cè)定血清中溶菌酶（LYS）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性及補(bǔ)體C3 的含量。

投喂4 周后，采用濃度為3×108cfu/mL 的殺鮭氣單胞菌進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。每尾魚(yú)注射0.2mL，統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組14d 內(nèi)死亡情況，按下式計(jì)算免疫保護(hù)率：免疫保護(hù)率=（1-實(shí)驗(yàn)組發(fā)病率/對(duì)照組發(fā)病率）×100%。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，采用SPSS13.0 進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)差異顯著時(shí)（P＜0.05），采用LSD 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)溶菌酶含量的影響

投喂非特異性免疫制劑對(duì)金鱒血清中溶菌酶含量的測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)曲線中R2=0.998，數(shù)據(jù)結(jié)果有效（圖1）。由圖2 可知，復(fù)合免疫增強(qiáng)劑添加量為0.5%時(shí)，第1 周金鱒血清中LYS 活性即達(dá)到最高值（5.35±0.09）U/mL，一直持續(xù)到第4 周（5.03±0.73）U/mL；當(dāng)復(fù)合免疫增強(qiáng)劑添加量到1.0%時(shí)，金鱒血清中LYS 活性隨投喂時(shí)間延長(zhǎng)先升高后降低，第2周達(dá)到最高值（5.42±0.38）U/mL，第4 周降低到（4.00±0.20）U/mL；當(dāng)復(fù)合免疫增強(qiáng)劑添加量在2.0%時(shí)，金鱒血清中LYS 活性隨投喂時(shí)間呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，在第2 周達(dá)到最高值（5.31±0.40）U/mL，第3 周降至（4.12±0.07）U/mL，可能添加量太高出現(xiàn)了免疫疲勞，第4 周為（4.62±0.37）U/mL，與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＜0.05）（圖2）。

2.2 對(duì)超氧化物氣化酶活性的影響

投喂非特異性免疫制劑對(duì)金鱒血清中超氧化物氣化酶活性的測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2=0.994，數(shù)據(jù)結(jié)果有效（圖3）。

由圖4 可知，當(dāng)復(fù)合免疫增強(qiáng)劑添加量在0.5%時(shí)，金鱒血清中SOD 活性隨投喂時(shí)間升高，在第2周達(dá)到較高值（167.17±6.11）U/mL，第3 周時(shí)降至（142.00±3.04）U/mL，第4 周時(shí)（167.83±4.64）U/mL；第3 周低于第2 周和第4 周，可能是實(shí)驗(yàn)誤差所致。當(dāng)復(fù)合免疫增強(qiáng)劑添加量為1.0%時(shí)，金鱒血清中SOD 活性隨投喂時(shí)間延長(zhǎng)先升高后降低，第2 周達(dá)最高值（152.16±3.88）U/mL，第4 周降至（136.00±4.77）U/mL；當(dāng)復(fù)合免疫增強(qiáng)劑添加量為2.0%時(shí)，金鱒血清中SOD 活性隨投喂時(shí)間先升高后降低，在第2 周達(dá)到最高值（151.00±4.82）U/mL，第3 周降至（124.67±10.49）U/mL，可能添加量太高出現(xiàn)了免疫疲勞，第4 周為（133.17±1.61）U/mL，與對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＜0.05）（圖4）。

2.3 對(duì)補(bǔ)體C3 含量的影響

投喂非特異性免疫制劑對(duì)金鱒血清中補(bǔ)體C3含量的測(cè)定和標(biāo)準(zhǔn)曲線R2=0.993，數(shù)據(jù)結(jié)果有效（圖5）。

由圖6 可知，當(dāng)復(fù)合免疫增強(qiáng)劑添加量在0.5%時(shí)，金鱒血清中C3 補(bǔ)體含量隨投喂時(shí)間延長(zhǎng)先升高后降低，第2 周達(dá)到較高值（102.67±3.41）μg/mL，第4 周時(shí)降為（92.91±3.12）μg/mL，但仍高于對(duì)照組的（78.08±6.79）μg/mL；當(dāng)復(fù)合免疫增強(qiáng)劑添加量為1.0%時(shí)，金鱒血清中SOD 含量隨投喂時(shí)間先升高后降低，第2 周達(dá)到最高值（105.58±2.02）μg/mL，第3 周降低到（96.00±1.73）μg/mL，第4 周與第3 周持平，但仍高于對(duì)照組（P＜0.05）；當(dāng)復(fù)合免疫增強(qiáng)劑添加量為2.0%時(shí)，金鱒血清中補(bǔ)體C3 含量隨投喂時(shí)間延長(zhǎng)先升高后降低，第2 周達(dá)到最高值（119.25±6.95）μg/mL，第4 周降為（94.67±1.84）μg/mL，但仍高于對(duì)照組（P＜0.05）（圖6）。

2.4 免疫保護(hù)率

由表1 可知，對(duì)照組在注射殺鮭氣單胞菌14d內(nèi)死亡率為80%，而各實(shí)驗(yàn)組的死亡率較對(duì)照組有所降低，其中0.5%實(shí)驗(yàn)組免疫保護(hù)率達(dá)到37.5%。

表1 金鱒攝食不同含量復(fù)合免疫增強(qiáng)劑的飼料后死亡率統(tǒng)計(jì)Tab.1 The statistics of mortality rate in golden trout（Oncorhynchus mykiss）fed diets containing various doses of compound immunostimulant

3 討論

3.1 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對(duì)金鱒血清中溶菌酶活性的影響

溶菌酶主要存在于魚(yú)的血清、粘液以及吞噬細(xì)胞中，是一種水解酶，具有防御各種病原體的作用，是魚(yú)體非特異性免疫功能主要標(biāo)志之一。艾春漢[8]等研究表明：黃芪、五味子、黨參等中草藥能顯著提高鯽Carassius auratus 血清中溶菌酶的活力。羅璋[9]等研究表明，酵母細(xì)胞壁提升了斑點(diǎn)叉尾Ictalurus punctatus 溶菌酶的活性，增強(qiáng)了抗嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila 感染的能力。胡兵[10]等發(fā)現(xiàn)添加0.05%黃芪多糖投喂異育銀鯽30d 后，血清溶菌酶活性達(dá)到最大值。胡宗云[11]等報(bào)道添加0.2%的硬葡聚糖對(duì)草魚(yú)Ctenopharyngodon idellus 溶菌酶活力影響極其顯著。王荻[12]等研究顯示復(fù)方中草藥顯著提高了施氏鱘Acipenser schrenckil 血漿等6種組織中的溶菌酶活力。Aramli 等[13]在飼料中添加0.2%和0.3%的β-葡聚糖，投喂波斯鱘Acipenser persicus 6 周后，可顯著提高血清中溶菌酶和總補(bǔ)體（ACH50）的含量。Ai Q 等[14]在飼料中添加0.09%和0.18%的β-葡聚糖，投喂大黃魚(yú)Pseudosciaena crocea 8 周后，血清中溶菌酶含量從對(duì)照組的97.00U/mL 分別提高到118.61U/mL 和131.87U/mL。本試驗(yàn)中的金鱒在投喂含0.5%免疫復(fù)合增強(qiáng)劑的飼料1 周后血清中溶菌酶的含量顯著高于對(duì)照組，一直持續(xù)到第3 周和第4 周后溶菌酶的含量略有降低，高于對(duì)照組，但差異不顯著。

3.2 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對(duì)金鱒血清中超氧化物歧化酶的影響

超氧化物歧化酶（SOD）是魚(yú)體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)。SOD 活性變化反映了機(jī)體清除自由基的能力，可增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的防御能力和機(jī)體的免疫功能。胡兵等[10]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可顯著提高異育銀鯽體內(nèi)的SOD 活性。李赫等[15]發(fā)現(xiàn)投喂含黃芪多糖、枸杞多糖和金絲桃素的飼料使草魚(yú)血清SOD 活性顯著高于對(duì)照組。李梅芳等[16]給大黃魚(yú)投喂不同中草藥飼料28d 內(nèi)，血清溶菌酶和超氧化物歧化酶活性隨投喂時(shí)間延長(zhǎng)而升高。本試驗(yàn)中，金鱒攝食含0.5%免疫復(fù)合增強(qiáng)劑的飼料1 周后血清中超氧化物歧化酶的活性顯著高于對(duì)照組，維持到第2 周，第3 周后降低，高于對(duì)照組，但差異不顯著。

3.3 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對(duì)金鱒血清中補(bǔ)體C3 含量的影響

補(bǔ)體系統(tǒng)是魚(yú)體免疫的重要組成部分，主要功能是促進(jìn)吞噬和溶解靶細(xì)胞。由補(bǔ)體介導(dǎo)的溶裂途徑清除病原是先天免疫反應(yīng)的重要效應(yīng)機(jī)制。樊英等[17]將黃芪多糖提取物來(lái)注射到刺參體腔，不同程度提高了刺參血清補(bǔ)體C3 的含量，起到了預(yù)防疾病的作用。盛竹梅等[18]將復(fù)方中草藥制劑投喂給黃顙魚(yú)Pelteobagrus fulvidraco 30d 后，黃顙魚(yú)血清中補(bǔ)體C3 和C4 的含量顯著高于對(duì)照組。孟兆娜等[19]投喂復(fù)方中草藥14d 和28d 后鏡鯉幼魚(yú)血清補(bǔ)體C3 含量顯著高于對(duì)照組。本試驗(yàn)中，第1 周各實(shí)驗(yàn)組金鱒血清中補(bǔ)體C3 的含量便開(kāi)始顯著高于對(duì)照組，一直持續(xù)到第4 周，與對(duì)照組之間仍具有顯著性差異。

3.4 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對(duì)金鱒抗病力的影響

在飼料中添加0.5%的復(fù)合免疫增強(qiáng)劑4 周后，金鱒感染殺鮭氣單胞菌的概率降低；進(jìn)一步加大復(fù)合免疫增強(qiáng)劑的添加量，效果反而會(huì)降低，可能是出現(xiàn)了免疫疲勞。長(zhǎng)期口服免疫增強(qiáng)劑會(huì)降低魚(yú)類免疫水平，可能是魚(yú)體的一種負(fù)反饋系統(tǒng)，使得免疫水平回落到最初的水平[20,21]。因此，投喂該復(fù)合免疫增強(qiáng)劑劑量不宜過(guò)高、時(shí)間也不宜過(guò)長(zhǎng)，兩到三周比較合適，避免出現(xiàn)免疫疲勞。間隔一段時(shí)間可繼續(xù)投喂，使得免疫水平長(zhǎng)期處于較高水平。

小結(jié)

目前，危害金鱒的疾病時(shí)有發(fā)生，使金鱒養(yǎng)殖業(yè)損失較大。本研究顯示，投喂0.5%復(fù)合免疫增強(qiáng)劑可有效提高金鱒血清中的溶菌酶、超氧化物歧化酶的活性、補(bǔ)體C3 的含量，增強(qiáng)了魚(yú)體對(duì)細(xì)菌病的抵抗力。