韓步鷹，孟玉瓊，劉小紅，田海寧，李長忠，馬睿

（1.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016；2.省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016）

虹鱒Oncorhynchus mykiss 是一種典型的肉食性冷水魚類，生存在澄清的低溫流水中[1]。2014 年全世界鮭鱒魚養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到264 萬t[2]。我國鮭鱒魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)起步較晚，2015 年全國鮭鱒魚養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到4.1 萬t[3]。青海以其得天獨(dú)厚的冷水資源成為全國最大的鮭鱒魚養(yǎng)殖基地，截止2018 年底，青海省鮭鱒魚養(yǎng)殖規(guī)模達(dá)到1.6 萬t 以上，主要養(yǎng)殖三倍體虹鱒[4]。三倍體虹鱒的性腺基本不發(fā)育，個體大、生長快、抗病力強(qiáng)、肉質(zhì)好、養(yǎng)殖周期短[5]。隨著養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的持續(xù)壯大，開發(fā)符合高原養(yǎng)殖條件的高效環(huán)保飼料成為限制產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要因素。

蛋白質(zhì)是魚體細(xì)胞的重要組成成分，對維持組織的生長、更新和修補(bǔ)等發(fā)揮著重要作用[6-8]。飼料中蛋白質(zhì)含量過高和過低都會影響魚類正常生長發(fā)育和飼料成本。二倍體虹鱒幼魚飼料的最適蛋白含量為49.0%～56.0%，成魚的最適蛋白含量為37.5%～50%[9]。Ma 等[10]研究認(rèn)為，三倍體虹鱒最適蛋白質(zhì)需求量為45.8%。但有關(guān)飼料蛋白質(zhì)水平對三倍體虹鱒腸道健康影響的研究較少。

腸道是魚體消化、吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，在免疫、內(nèi)分泌、屏障等方面發(fā)揮著重要作用[11]。因此，維持魚類腸道的健康至關(guān)重要。魚類腸道的健康與結(jié)構(gòu)完整性密切相關(guān)[12-14]。許多研究表明，蛋白源對魚類腸道結(jié)構(gòu)有重要影響[15-19]，然而飼料蛋白質(zhì)水平對魚類腸道結(jié)構(gòu)的影響報道較少。

本研究通過分析不同飼料蛋白質(zhì)水平對三倍體虹鱒生長性能和腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，確定蛋白質(zhì)營養(yǎng)與魚類腸道健康之間的關(guān)系，以期為豐富三倍體虹鱒營養(yǎng)生理學(xué)內(nèi)容及研發(fā)高效環(huán)保飼料提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)魚來自青海民澤龍羊峽生態(tài)水殖有限公司，初始體質(zhì)量為（233.30±0.39）g。

試驗(yàn)飼料以魚粉為蛋白質(zhì)源，魚油和大豆油為脂肪源，小麥粉和玉米淀粉為主要碳水化合物源，配制3 種等脂（20%干物質(zhì)）和等能量（20kJ/g）的飼料。飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。凱氏定氮法測定表明：飼料粗蛋白質(zhì)水平分別為35.4%、43.3%和52.4%。

試驗(yàn)飼料由通威股份有限公司特種飼料分公司代加工成緩沉型膨化飼料后，在4℃下保存至使用。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平（%干物質(zhì)）。Tab.1 Ingredient and proximate compositions of the experimental diets（% dry matter）

1.2 方法

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在青海省龍羊峽水庫進(jìn)行80d。在實(shí)驗(yàn)開始前將試驗(yàn)魚暫養(yǎng)兩周，期間投喂商業(yè)飼料（含43%粗蛋白，18%粗脂肪），每天投喂2 次（8:30和16:30）。暫養(yǎng)結(jié)束后，將魚禁食48h 后稱重，選擇規(guī)格一致的健康三倍體虹鱒1200 尾，隨機(jī)分配到12 個養(yǎng)殖網(wǎng)箱（3m×3m×6m）中，每個網(wǎng)箱100 尾，每種飼料4 個網(wǎng)箱。

試驗(yàn)期間，水溫范圍為8～16℃，溶解氧高于7mg/L，pH8.5 左右，氨氮含量為0.02mg/L，硝氮含量為0.9～1.1mg/L，正午光照強(qiáng)度為110000LUX。每天飽食投喂2 次（8:30 和16:30）。

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時，停食24h，從每個養(yǎng)殖網(wǎng)箱中取3 尾魚用丁香酚（1∶10000）麻醉后稱重，測量體長，然后迅速解剖，測量腸道長度，取中腸用生理鹽水沖洗干凈，取約1cm3的新鮮腸道組織置于4%多聚甲醛中固定后，帶回實(shí)驗(yàn)室制備腸道組織切片；另取1cm 左右中腸管3 塊，縱向剖開，暴露腸粘膜部分，立即投入2.5%戊二醛電鏡專用固定液中固定，用于制備掃描電鏡樣品。

飼料成分分析：飼料的干物質(zhì)、粗脂肪和粗蛋白含量參照AOAC（Association of Offcial Analytical Chemists）標(biāo)準(zhǔn)方法測定[20]。將飼料樣品在105℃下干燥至恒重以測定干物質(zhì)含量，粗脂肪、粗蛋白含量和能量分別采用索氏提取法（36680-analyer，BUCHI，瑞士）、凱氏定氮法（2300-Auto-analyzer，F(xiàn)OSS，丹麥）和絕熱氧彈儀（IKACalorimeter，C400，德國）測定。

腸道組織切片和形態(tài)的測定：固定24h 后的腸道組織用水多次沖洗去除固定液，經(jīng)過乙醇逐級脫水、二甲苯透明，透明后的組織于60℃浸蠟2h 并包埋，采用切片機(jī)（LEICA，RM2235）切片，厚度6μm，蘇木精-伊紅（HE）染色、中性樹脂封片。用顯微鏡（Nikon，DS-Ri2）觀察并拍照，圖像由ImagesJ 軟件進(jìn)行測量。每組腸道切片樣測量10 個（每組4 個重復(fù)，共40 個）腸道皺襞高度、肌層厚度、微絨毛厚度、上皮細(xì)胞厚度以及杯狀細(xì)胞數(shù)量。取其平均值作為該樣品各指標(biāo)的測定結(jié)果。

腸道掃描電鏡樣品制作：將腸道掃描電鏡樣品用磷酸緩沖液進(jìn)行漂洗,乙醇梯度脫水、冷凍干燥、鍍膜，在掃描電子顯微鏡（JSM-6610LV 型）下觀察。

計算公式和統(tǒng)計分析：特定生長率（Specific growth rate，SGR，%d）=100×[ln（魚終體質(zhì)量）-ln（魚初體質(zhì)量）]/實(shí)驗(yàn)天數(shù)；

腸長指數(shù)（intestinal length index，ILI%）=（腸長/體長）×100；

Zihler 指數(shù)（Zihler's index，ZI）=腸長（mm）/[10×（體質(zhì)量（g）1/3）][21]。

所得數(shù)據(jù)用（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）表示。用SPSS 19.0 數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），采用Duncan 檢驗(yàn)方法比較組間差異顯著性，以P＜0.05 為顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料蛋白水平對三倍體虹鱒生長和腸道指數(shù)的影響

由表2 可知，隨著飼料蛋白質(zhì)水平的增加，三倍體虹鱒特定生長率顯著上升（P＜0.05），在飼料蛋白質(zhì)水平為52.4%時達(dá)到最大值（1.27±0.01）%/d，而腸長指數(shù)和Zihler 指數(shù)顯著下降（P＜0.05），兩者均在飼料蛋白質(zhì)水平為52.4%時顯著低于35.4%飼料蛋白質(zhì)組（P＜0.05）。

2.2 飼料蛋白水平對三倍體虹鱒腸道組織形態(tài)的影響

如圖1 所示，在100 倍鏡下（圖1-a1/b1/c1），低蛋白質(zhì)組三倍體虹鱒腸道的皺襞高度參差不齊，部分黏膜褶皺形狀不完整（圖1-a1）；中蛋白質(zhì)組三倍體虹鱒腸道的皺襞高度和寬度不均一，黏膜褶皺形狀較細(xì)且筆直伸入腸腔內(nèi)（圖1-b1）；高蛋白質(zhì)組三倍體虹鱒腸道皺襞高度均一，腸黏膜層向腸腔內(nèi)折疊形成豐富的黏膜褶皺，有的筆直伸人腸腔內(nèi)，有的彎曲伸展，排列緊密，整體皺襞高度明顯高于前兩組（圖1-c3）。在200 倍鏡下（圖1-a2/b2/c2），低蛋白質(zhì)組肌層較厚而致密（圖1-a2）；中蛋白質(zhì)組漿膜和肌層中間產(chǎn)生空隙分層（圖1-b2）。高蛋白質(zhì)組肌層疏松，較?。▓D1-c2）。在400 倍鏡下（圖1-a3/b3/c3），低蛋白質(zhì)組微絨毛細(xì)長且排列緊密整齊，可見較多的杯狀細(xì)胞（圖1-a3）；中蛋白質(zhì)組黏膜褶皺邊緣有破損且明顯變細(xì)，上皮細(xì)胞核排列紊亂，邊緣缺刻較多（圖1-b3）；高蛋白質(zhì)組上皮細(xì)胞明顯較其他組厚，單根絨毛上的杯狀細(xì)胞較少（圖1-c3）。

表2 飼料蛋白水平對三倍體虹鱒生長和腸道指數(shù)的影響Tab.2 Effect of dietary protein levels on growth and intestinal index of triploid rainbow trout

表3 飼料蛋白水平對三倍體虹鱒腸道形態(tài)參數(shù)的影響Tab.3 Effects of dietary protein level on intestinal morphological parameters of triploid rainbow trout

2.3 飼料蛋白質(zhì)水平對三倍體虹鱒腸道形態(tài)參數(shù)的影響

由表3 可知，隨著飼料蛋白質(zhì)水平的提高，三倍體虹鱒的腸道皺襞高度和上皮細(xì)胞厚度呈上升的趨勢，當(dāng)飼料蛋白質(zhì)水平為52.4%時達(dá)到最大值；三倍體虹鱒腸道微絨毛高度和肌層厚度呈下降趨勢，低飼料蛋白質(zhì)組顯著高于高飼料蛋白質(zhì)組（P＜0.05）；飼料蛋白質(zhì)水平對三倍體虹鱒腸道組織中杯狀細(xì)胞數(shù)量無顯著性影響（P＞0.05）。

2.4 三倍體虹鱒攝食不同蛋白質(zhì)水平飼料時腸道的掃描電鏡觀察

由圖2 可知，在100 倍鏡下（圖2-a1/b1/c1），不同飼料蛋白質(zhì)水平組三倍體虹鱒腸道的粘膜上皮表面隆起形成的皺褶有一定差異，粘膜褶皺形態(tài)多樣，有“V”型，“Z”型、“S”型等，無明顯規(guī)律。低蛋白質(zhì)組三倍體虹鱒腸道的褶皺隆起幅度較低，排列較緊密（圖2-a1）；中蛋白質(zhì)組三倍體虹鱒腸道褶皺隆起幅度明顯，形狀多樣，排列疏松（圖2-b1）；高蛋白質(zhì)組三倍體虹鱒腸道的褶皺隆起幅度較高，在同一鏡檢距離時明暗程度不一，褶皺程度較前兩組低（圖2-c1）。在2000 倍鏡下（圖2-a2/b2/c2），低蛋白質(zhì)組各部的細(xì)胞界限較模糊，基本分辨不出，腸道表面有較多的分泌孔（圖2-a2）；中蛋白質(zhì)組細(xì)胞之間有裂痕，且相鄰處有較深的溝壑（圖2-b2）。高蛋白質(zhì)組細(xì)胞界限清楚，呈多邊形，排列整齊（圖2-c2）；在6000 倍鏡下（圖2-a3/b3/c3），低蛋白質(zhì)組腸表面分泌孔的四周比較平滑，可見顆粒狀分泌物（圖2-a3）；中蛋白質(zhì)組腸道表面分泌孔四周有縫隙，有少量顆粒狀分泌物（圖2-b3）；高蛋白質(zhì)組腸道表面分泌孔四周較平滑，有較多顆粒狀的分泌物（圖2-c3）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼料蛋白質(zhì)水平的升高，三倍體虹鱒的特定生長率逐漸升高，類似的結(jié)果在黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco[22]、寶石鱸Scortum barcoo 幼魚[23]和俄羅斯鱘Acipenser gueldenstaedti 幼鱘[24]中也有報道。較高飼料蛋白質(zhì)水平促進(jìn)魚類生長的原因可能與魚類的消化吸收有關(guān)[25]。本研究通過觀察腸道組織結(jié)構(gòu)變化探討飼料蛋白水平影響三倍體虹鱒生長的原因。

本研究中，投喂高蛋白質(zhì)水平飼料時，三倍體虹鱒腸長指數(shù)和ZI 指數(shù)變小。腸長指數(shù)和ZI 指數(shù)經(jīng)常用來反映魚類食性的主要特征。一般來說，肉食性魚類的腸較短，約為體長的1/3～3/4，而草食性和雜食性魚類的腸較長，可達(dá)體長的2～5 倍[26]。ZI指數(shù)按照食性排序?yàn)槿馐承贼~類＜雜食性魚類＜草食性魚類[27]。本研究分析了三倍體虹鱒腸長指數(shù)和ZI 指數(shù)表明，三倍體虹鱒與肉食性魚類的特征相一致，其消化能力和腸道結(jié)構(gòu)與食性相適應(yīng)。腸的長短可以反映對食物消化的難易程度。隨著飼料蛋白質(zhì)水平的升高，三倍體虹鱒腸長變短。前期研究表明，在魚類消化代謝旺盛的暖季腸長比冬季短[28]。因此，投喂高蛋白質(zhì)水平飼料可能提高了魚體消化代謝水平，導(dǎo)致腸長變短。腸道長度的變化與腸道組織形態(tài)的變化密切相關(guān)。對二倍體虹鱒的研究表明：腸道皺襞高度是反映水生動物腸道生長發(fā)育和吸收能力的重要標(biāo)識。營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收與腸道皺襞高度密切相關(guān)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，投喂高蛋白質(zhì)水平飼料組三倍體虹鱒腸道皺襞高度和上皮細(xì)胞厚度增加。郭斌等[30]對大菱鲆Scophthalmus maximus 的研究表明，皺襞高度與腸道的營養(yǎng)吸收面積密切相關(guān)，皺襞越高，面積越大，越有利于吸收。投喂高蛋白質(zhì)水平飼料后，三倍體虹鱒可能通過增加腸道吸收面積，食糜團(tuán)與腸壁充分接觸促進(jìn)了消化吸收[31,32]。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，投喂高蛋白質(zhì)水平飼料后腸道分泌物較多，食糜團(tuán)可以和較多的腸道分泌物相融合，有助于食物的消化吸收，對腸壁也有潤滑作用。因此，投喂高蛋白質(zhì)水平飼料促進(jìn)三倍體虹鱒生長的原因可能是通過增大腸道吸收面積，提高魚體對營養(yǎng)素吸收利用能力。

投喂低蛋白質(zhì)水平飼料時，三倍體虹鱒腸道粘膜皺襞高度變小，肌層厚度增加。有研究表明，腸道粘膜皺襞高度降低，肌層厚度增加，是炎癥反應(yīng)導(dǎo)致[33-35]。腸道不僅負(fù)責(zé)消化和吸收營養(yǎng)素，還涉及水生動物的免疫力，因此，投喂低蛋白質(zhì)飼料后三倍體虹鱒可能會引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致生長緩慢。

綜上所述，飼料蛋白質(zhì)水平顯著影響三倍體虹鱒生長、腸道長度和形態(tài)結(jié)構(gòu)。較高飼料蛋白質(zhì)水平促進(jìn)三倍體虹鱒生長與腸道結(jié)構(gòu)的變化密切相關(guān)：高蛋白質(zhì)水平飼料（52.4%）增大了魚腸道表面積，提高了飼料的消化吸收率；低蛋白質(zhì)水平飼料（35.4%）可導(dǎo)致腸道炎癥反應(yīng)。