朱作藝，張玉，王君虹，李雪，王偉,2*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021；2.浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州 310021)

紫苑(AstertataricusL.F.)為菊科植物的干燥根及根莖，作為傳統(tǒng)中藥已經(jīng)具有2 000多年的歷史，具有潤(rùn)肺下氣、化痰止咳的功能[1]，主要分布于東北、華北地區(qū)，以及甘肅、安徽等省，現(xiàn)已在國(guó)內(nèi)大面積種植。紫苑環(huán)肽(astins)是從紫苑根莖中分離出來的一類鹵代的環(huán)五肽類，目前已鑒定的紫苑環(huán)肽結(jié)構(gòu)有3種，分別為astin A、astin B和astin C。有文獻(xiàn)報(bào)道，astin A、astin B和astin C具有抗腫瘤活性[2]、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬的作用[3]。

酵母細(xì)胞同其他真核生物一樣，在生長(zhǎng)過程中要不斷承受來自內(nèi)外環(huán)境的壓力。正常需氧條件下，酵母細(xì)胞中的代謝副產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子、羥基自由基和過氧化氫等內(nèi)源性活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)。外界環(huán)境中的電離輻射、氧化還原劑或重金屬等也能刺激細(xì)胞產(chǎn)生這些活性氧形態(tài)。在氧化脅迫條件下，酵母會(huì)產(chǎn)生過多的活性氧自由基。當(dāng)細(xì)胞中累積的這些活性氧物質(zhì)超過了細(xì)胞抗氧化防御緩沖能力時(shí)，會(huì)對(duì)酵母細(xì)胞的許多重要生物大分子發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的氧化損傷，使核酸、蛋白質(zhì)、膜多不飽和脂肪酸等出現(xiàn)交聯(lián)或斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，甚至造成細(xì)胞死亡[4-8]。

本文建立以H2O2為氧化誘導(dǎo)劑的釀酒酵母細(xì)胞模型，從細(xì)胞存活率、細(xì)胞生長(zhǎng)表型分析和ROS含量等不同方面來研究紫苑環(huán)肽(astin A和astin B)對(duì)氧化受損的酵母細(xì)胞的保護(hù)作用，為進(jìn)一步研究紫苑環(huán)肽活性物質(zhì)和后續(xù)的功能食品、保健品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

紫苑環(huán)肽(astin A，純度95%；astin B，純度95%，吉爾生化(上海)有限公司合成)；野生型釀酒酵母細(xì)胞BY4742(武漢淼靈生物科技有限公司)；瓊脂粉(青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司)；酵母提取物(杭州微生物試劑有限公司)；胰蛋白胨(國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司)；葡萄糖(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；30%過氧化氫(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氯化鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；酵母破壁酶溶液(上海索萊寶生物技術(shù)有限公司)；真菌/酵母氧化應(yīng)激活性氧(ROS)比色法定量試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)；細(xì)胞凋亡試劑盒(杭州聯(lián)科生物公司)。

pH計(jì)(FE28，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；DHP-9602恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)(蘇州蘇凈有限公司)；MX-S混勻儀(大龍興創(chuàng)試驗(yàn)儀器(北京)有限公司)；紫外-可見光分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)；TDL-60B低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭設(shè)備有限公司)；MicroPure UV/UF純水儀(美國(guó)Thermo公司)；ACCURI C6流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 紫苑環(huán)肽溶液的配制

將5 mg合成的高純環(huán)肽(astin A和astin B)溶于含1%二甲基亞砜(DMSO)的5 mL無菌蒸餾水中，配制成環(huán)肽母液，使用時(shí)以1∶100比例加入培養(yǎng)基中。

1.2.2 YPD培養(yǎng)基配制

稱取20.0 g胰蛋白胨，10.0 g酵母提取物，20.0 g葡萄糖，若配制固體培養(yǎng)基，則再加20.0 g瓊脂粉。將上述成分加入到1 000 mL蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2，分裝后于121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2.3 生理鹽水配制

稱取氯化鈉8.5 g，加入1 000 mL蒸餾水，加熱溶解，分裝后121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2.4 試驗(yàn)細(xì)胞分組

從平板上挑取酵母菌于YPD培養(yǎng)基中30 ℃預(yù)培養(yǎng)，以終濃度D600=0.05轉(zhuǎn)移至新鮮YPD中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，收集細(xì)胞調(diào)節(jié)濃度至D600=2.0(為酵母細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，使細(xì)胞濃度大約為5×107CFU·mL-1)。按照以下分組，加入2種環(huán)肽和2 mmol·L-1H2O2處理酵母細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)。

NC：YPD+2 mmol·L-1H2O2；astin A：YPD+10 mg·L-1astin A；astin B：YPD+10 mg·L-1astin B；H2O2+ astin A：PD+2 mmol·L-1H2O2+10 mg·L-1astin A；H2O2+ astin B：YPD+2 mmol·L-1H2O2+10 mg·L-1astin B。

1.2.5 酵母細(xì)胞表型生長(zhǎng)觀察

按照上述分組處理酵母細(xì)胞，37 ℃作用90 min后離心收集菌體，用無菌生理鹽水清洗藥物，并重懸于1 mL生理鹽水中，然后進(jìn)行梯度稀釋，每個(gè)梯度按1∶10進(jìn)行稀釋，直至稀釋到1∶1 000，然后將每個(gè)稀釋濃度從高濃度到低濃度各取5 μL，按照從左到右順序依次滴加于YPD固體平板上。待菌液完全滲透到培養(yǎng)基后，將平板倒置30 ℃培養(yǎng)2 d。將培養(yǎng)完成后的YPD平板進(jìn)行拍照記錄。

1.2.6 酵母活性氧(ROS)測(cè)定

按照上述分組處理酵母細(xì)胞，37 ℃作用2 h后離心收集菌體，用無菌生理鹽水清洗藥物，棄上清液。按照真菌/酵母氧化應(yīng)激活性氧(ROS)比色法定量試劑盒說明書測(cè)定各組酵母菌活性氧含量。

1.2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞壞死凋亡

按照上述分組處理酵母細(xì)胞，37 ℃作用2 h后離心收集細(xì)胞，用生理鹽水洗滌2次，加入500 μL 15U·mL-1酵母破壁酶溶液，28 ℃培養(yǎng)1 h進(jìn)行去壁。離心收集細(xì)胞，用生理鹽水去除酶液，將細(xì)胞重懸在100 μL Binding Buffer上樣緩沖液中。先在每個(gè)樣品加入5 μL Annexin V，混勻且室溫下避光10 min，之后在每個(gè)樣品中加入5 μL PI。室溫下避光反應(yīng)5 min。之后再加入400 μL Binding Buffer上樣緩沖液，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫苑環(huán)肽對(duì)釀酒酵母細(xì)胞表型生長(zhǎng)情況的影響

從不同組別菌液在YPD平板上生長(zhǎng)狀態(tài)(圖1)可知，在培養(yǎng)菌液中加入2 mmol·L-1H2O2(YPD+H2O2組)，相較于YPD+10 mg·L-1astins環(huán)肽組，其菌落成活率在稀釋1 000倍時(shí)有明顯下降，然而向氧化脅迫的酵母細(xì)胞體系中加入環(huán)肽干預(yù)(YPD+H2O2+10 mg·L-1astins環(huán)肽組)，可明顯提高酵母細(xì)胞的成活率。從1∶1 000倍稀釋的菌液在YPD平板上生長(zhǎng)狀態(tài)可知，YPD+H2O2+10 mg·L-1astin A組別的酵母細(xì)胞成活率高于YPD+H2O2+10 mg·L-1astin B組。表明在氧化脅迫體系中，紫苑環(huán)肽astin A對(duì)酵母細(xì)胞的保護(hù)效果優(yōu)于紫苑環(huán)肽astin B。

2.2 紫苑環(huán)肽對(duì)釀酒酵母細(xì)胞活性氧含量的影響

通過檢測(cè)不同組別真核細(xì)胞(酵母)的活性氧ROS含量的變化情況，研究紫苑環(huán)肽對(duì)氧化脅迫條件下酵母細(xì)胞的保護(hù)作用。由圖2可知，對(duì)照組ROS含量顯著高于astin A和astin B，說明在H2O2的氧化脅迫下，酵母細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯上升，astin A和astin B的ROS含量顯著下降，其他各組活性氧ROS含量相較于對(duì)照組均有顯著降低(P<0.05)。

2.3 紫苑環(huán)肽對(duì)酵母細(xì)胞壞死凋亡情況的影響

由圖3可知，加入H2O2后的酵母菌出現(xiàn)大量壞死，細(xì)胞壞死率為96.5%，極顯著高于其他處理。astin A處理的細(xì)胞壞死率和凋亡率均為0.8%，而H2O2+astinA處理組細(xì)胞壞死率和凋亡率分別為30.7%和0.7%；astin B處理的細(xì)胞壞死率和凋亡率分別為0.8%和0.6%，而H2O2+astin B處理的細(xì)胞壞死率和凋亡率分別為35.9%和1.5%。由此可知，紫苑環(huán)肽對(duì)正常酵母細(xì)胞無損傷作用，但可顯著降低酵母細(xì)胞的壞死率(P<0.001)，通過分別加入10 mg·L-1的astin A和astin B至H2O2處理的酵母細(xì)胞，其壞死率從96.5%分別降至30.7%和35.9%，表明紫苑環(huán)肽對(duì)氧化脅迫的酵母細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用。

**表示與對(duì)照比差異極顯著(P<0.01)。

3 小結(jié)

通過研究氧化脅迫的野生型釀酒酵母細(xì)胞在紫苑環(huán)肽作用下的生長(zhǎng)表型情況、活性氧含量及細(xì)胞壞死凋亡情況，證實(shí)紫苑環(huán)肽對(duì)由H2O2引起的氧化損傷釀酒酵母細(xì)胞具有保護(hù)作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，紫苑環(huán)肽能顯著提高氧化脅迫下釀酒酵母細(xì)胞的存活率，降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量，這為進(jìn)一步研究開發(fā)紫苑在食品、藥品及人類健康方面的應(yīng)用提供了重要依據(jù)。