楊夢(mèng)婷，余紅，忻雅，龐基良*

(1.杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036；2.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310024)

草莓(Fragaria×ananassaDuch.)屬薔薇科多年生草本植物，不僅有獨(dú)特的口味還有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是最受生產(chǎn)者和消費(fèi)者歡迎的水果之一，素有“水果皇后”之稱，其生產(chǎn)遍布世界各地，目前中國的草莓栽培面積和產(chǎn)量均居世界第一[1]。我國雖然擁有極為豐富的野生草莓資源，但幾乎均為一季結(jié)果型草莓，較長(zhǎng)的夏秋季節(jié)(6—11月)是草莓生產(chǎn)空缺期，市場(chǎng)上幾乎沒有新鮮草莓上市，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們對(duì)草莓的周年需求。1997年，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)羅新書教授從美國和加拿大引進(jìn)2個(gè)草莓新品種[2]，其一年四季結(jié)果的特性，解決了我國夏秋季節(jié)無草莓供應(yīng)的市場(chǎng)問題，實(shí)現(xiàn)了草莓的周年生產(chǎn)與供應(yīng)。這說明了草莓開花時(shí)間調(diào)控的研究具有一定的經(jīng)濟(jì)及市場(chǎng)效應(yīng)。

目前，我們對(duì)栽培草莓開花的環(huán)境控制及激素影響已進(jìn)行了廣泛的研究[3-7]，但對(duì)草莓內(nèi)在的成花調(diào)控的分子機(jī)制了解甚少。LFY、SOC1、AP1和FT及其同源開花基因在高等植物的成花過程中具有重要作用。LFY基因是目前研究最多，了解最清楚的一個(gè)基因，不僅控制著花序分生組織向花分生組織的轉(zhuǎn)變，而且還控制著開花時(shí)間[8]。相關(guān)報(bào)道顯示，草莓LFY基因在成花初期的花芽中表達(dá)量最高，說明其在促進(jìn)花形成過程中發(fā)揮作用[9]。SOC1基因能夠與其他基因相互作用共同調(diào)節(jié)植物開花時(shí)間以及花的類型及花分生組織。相關(guān)研究顯示，SOC1基因的過表達(dá)可以有效地促進(jìn)早花，而SOC1突變體則會(huì)引起開花時(shí)間的延遲[10-12]。已有報(bào)道，草莓SOC1基因與其他SOC1同源物具有高度同一性，含有保守的MADS結(jié)構(gòu)域和SOC1基序，是草莓中的開花促進(jìn)劑[13]。AP1基因既屬于花分生組織特征基因，又是花器官形態(tài)特征基因，在控制植物花分生組織特性與花器官的形成過程中起著重要的作用[14]。有研究表明，草莓AP1基因的表達(dá)與草莓的生殖生長(zhǎng)密切相關(guān)，推測(cè)其在草莓花分生組織形成和花器官發(fā)育中有一定的調(diào)控作用[15]。FT基因編碼的蛋白產(chǎn)物可以長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)運(yùn)成花激素，所以是植物成花轉(zhuǎn)變過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，對(duì)花的形成具有決定作用[16-17]。已有研究證明，短日或低溫刺激會(huì)誘導(dǎo)草莓FT基因表達(dá)從而促進(jìn)開花[18]，更有猜測(cè)草莓FT基因在草莓低溫休眠和果實(shí)膨大過程中發(fā)揮重要作用[19]。

近年來，科學(xué)家們相繼在草莓中克隆得到成花關(guān)鍵基因，并對(duì)其功能進(jìn)行研究，但有關(guān)草莓成花的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還有待揭示，尚未見一季草莓與四季草莓成花分子差異的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究將對(duì)一季草莓品種章姬與四季草莓品種蒙特瑞的4個(gè)成花關(guān)鍵基因LFY、SOC1、AP1和FT的表達(dá)量進(jìn)行比較分析，初步探討四季草莓周年開花的機(jī)制，為進(jìn)一步了解草莓成花分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)，為其他農(nóng)作物培育四季品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

一季草莓品種章姬與四季草莓品種蒙特瑞于2018年11月20日從杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院草莓種植基地移栽至杭州師范大學(xué)塑料大棚內(nèi)，進(jìn)行常規(guī)栽培管理。于2019年1月至5月間進(jìn)行取樣，每次取樣時(shí)間間隔約半個(gè)月(1月15日、1月30日、2月15日、2月28日、3月15日、3月30日、4月15日、4月30日、5月15日、5月30日)，樣品皆為嫩葉，每份樣品約1 g，重復(fù)3次。

1.2 引物

利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)LFY基因引物，其余引物參照Nakano等[18]和Lei等[13]，引物序列見表1。

表1 本研究所用的引物序列

1.3 RNA的提取

用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒提取總RNA。利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性，用核酸蛋白分析儀檢測(cè)RNA的純度。

1.4 RT-PCR

反轉(zhuǎn)錄體積為20 μL在0.2 L反應(yīng)管中加入總RNA 7 μL、Primer Mix 2 μL、dNTP Mix 4 μL、DTT 2 μL、RT Buffer 4 μL、HiFiSript 1 μL，混勻后先42 ℃孵育15 min，再85 ℃孵育5 min，然后迅速置于冰上冷卻，完成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取1 μL cDNA用核酸蛋白分析儀檢測(cè)其純度。取1 μL cDNA加入5 μL 2×Trans Mix，0.5 μL上下游引物，1 μL DNA，3 μL ddH2O進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性35 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括0.5 μL cDNA(400 ng·μL-1)，濃度為10 μmol·L-1的上下游引物各0.2 μL，5 μL 2×UltraSYBR Mixture(High ROX)，最后用ddH2O補(bǔ)足到10 μL。以草莓Actin為內(nèi)參基因，每個(gè)樣本做4次重復(fù)，反應(yīng)條件如下：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 32 s，38個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量的高低。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)期蒙特瑞與章姬嫩葉總RNA檢測(cè)

用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒成功提取到草莓總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示，28S rRNA和18S rRNA兩條譜帶清晰明亮，且都沒有明顯的拖帶，D260/D280比值為1.91～2.06，說明提取的RNA較純凈，無蛋白及化學(xué)試劑污染，可以用于反轉(zhuǎn)錄、常規(guī)PCR以及定量PCR等后續(xù)研究。

2.2 草莓成花關(guān)鍵基因的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，使得每一個(gè)循環(huán)可見，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法[20]。本實(shí)驗(yàn)利用2-△△Ct方法進(jìn)行一季草莓品種章姬與四季草莓品種蒙特瑞不同時(shí)期LFY、SOC1、AP1和FT基因的相對(duì)定量計(jì)算。以2019年1月15日所取的材料作為對(duì)照，其LFY、SOC1、AP1和FT基因的表達(dá)量定義為1個(gè)單位，對(duì)其他階段的表達(dá)量進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明：LFY、SOC1、AP1和FT四個(gè)基因在一季草莓章姬和四季草莓蒙特瑞中不同時(shí)期的表達(dá)趨勢(shì)基本一致。1月15日至1月30日，蒙特瑞和章姬的LFY基因表達(dá)都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而3月15日至4月15日都呈下降趨勢(shì)。章姬中LFY基因表達(dá)峰值出現(xiàn)在2月28日；而蒙特瑞中LFY基因表達(dá)峰值出現(xiàn)在3月15日(圖2)。5月15日，蒙特瑞和章姬的SOC1基因均出現(xiàn)表達(dá)高峰。蒙特瑞中SOC1基因相對(duì)表達(dá)量在整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)期整體均高于章姬中的SOC1基因。1月15日至 1月30日，蒙特瑞和章姬中AP1基因表達(dá)都呈上升趨勢(shì)，隨后章姬繼續(xù)上升，并于3月15日出現(xiàn)表達(dá)峰值；而在蒙特瑞中AP1基因表達(dá)在1月30日之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，直至2月28日才重新呈上升趨勢(shì)，其表達(dá)峰值同樣出現(xiàn)在3月15日。1月15日至5月30日，章姬中FT基因相對(duì)表達(dá)量始終高于蒙特瑞中FT基因相對(duì)表達(dá)量，且在3月15日，均出現(xiàn)表達(dá)高峰。

1～3為蒙特瑞的RNA；4～6為章姬的RNA；A～J為不同取材時(shí)間提取的RNA，取材時(shí)間分別為2019年1月15日、1月30日、2月15日、2月28日、3月15日、3月30日、4月15日、4月30日、5月15日、5月30日。

圖2 蒙特瑞和章姬不同時(shí)期嫩葉中FaLFY、FaSOC1、FaAP1和FaFT基因的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

成花轉(zhuǎn)變是植物生長(zhǎng)發(fā)育中的重要過程，這一轉(zhuǎn)變受遺傳和環(huán)境等多因子控制[21]。近年來，人們已應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆了多種作物的一系列成花相關(guān)基因，并深入研究了這些基因的調(diào)控機(jī)理[22-24]。LFY基因是植物的花分生組織特征基因，是目前研究最透，也是最重要的基因。該同源基因在很多植物中都在花序分生組織轉(zhuǎn)變?yōu)榛ǚ稚M織和成花誘導(dǎo)過程中發(fā)揮作用[25-27]。LFY基因不僅可以控制花序分生組織向花分生組織的轉(zhuǎn)變[28]，還控制開花時(shí)間[8]。從本研究結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，一季草莓章姬在2月28日表達(dá)量最高，大約兩個(gè)半月后(5月15日)其表達(dá)量出現(xiàn)小峰值；四季草莓蒙特瑞在3月15日表達(dá)量最高，1月30日與4月30日其表達(dá)量都出現(xiàn)小峰值，三者時(shí)間間隔皆為一個(gè)半月，并且2個(gè)小峰值均高于章姬的小峰值，說明LFY在促進(jìn)四季草莓周年成花形成過程中發(fā)揮了重要作用。

SOC1是MADS-box基因家族的一員，能夠整合來自光周期途徑、春化途徑、自主途徑和赤霉素途徑的花時(shí)基因信號(hào)[10,29]，進(jìn)而募集其他功能蛋白或與功能蛋白互作[30]，改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)形態(tài)并作用于下游花分生組織特異基因，從而促進(jìn)植物的開花。本研究中，SOC1在蒙特瑞和章姬中都穩(wěn)定表達(dá)，但在蒙特瑞中不同時(shí)期的SOC1表達(dá)量都普遍高于章姬，表明SOC1是調(diào)控四季草莓成花轉(zhuǎn)變的重要基因。AP1也是調(diào)節(jié)花發(fā)育的重要基因，其功能與LFY部分冗余，表達(dá)時(shí)期晚于LFY，兩者具有加性效應(yīng)，能相互促進(jìn)表達(dá)[31]。AP1/FUL在擬南芥與煙草中的直向同源基因的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致早期開花，并且這些基因可以調(diào)節(jié)不同的下游基因以執(zhí)行不同的花發(fā)育相關(guān)功能[32-33]。在本研究中，AP1基因與LFY基因的表達(dá)趨勢(shì)基本一致，但AP1基因表達(dá)量整體遠(yuǎn)高于同期LFY基因的表達(dá)值，且在1月30日至3月15日，章姬中AP1基因的表達(dá)量變化波動(dòng)較大，而蒙特瑞基本穩(wěn)定表達(dá)，這可能就導(dǎo)致了章姬只能一季成花。

許多研究表明，F(xiàn)T基因及其同源物可以調(diào)節(jié)植物開花[34-36]。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)T基因?qū)ǖ男纬删哂袥Q定作用[16-17]。Nakano等[18]在草莓中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)T基因在環(huán)境誘因控制的花感應(yīng)中起重要作用，且其表達(dá)相比葉片光周期信號(hào)的調(diào)節(jié)，更顯著地受到溫度的調(diào)控。在本研究中，F(xiàn)T基因在蒙特瑞和章姬中都穩(wěn)定表達(dá)，且章姬中的表達(dá)量始終高于蒙特瑞中的表達(dá)量，F(xiàn)T基因?qū)λ募静葺苫ǖ淖饔没蚴艿蕉嗷蚨嗤緩秸{(diào)控，其表達(dá)豐度差異不顯著。