陳敏，謝發(fā)，游玲,2，王濤,2*

1(宜賓學院 生命科學與食品工程學院，四川 宜賓， 644000)2(固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，宜賓學院，四川 宜賓， 644000)

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)是主要存在于茯磚茶中的一種益生真菌，可產(chǎn)生金黃色閉囊殼，即“金花”[1]，該菌是影響茯磚茶品質(zhì)的重要因素，不僅可以降低茶的澀味，其菌花香及產(chǎn)生的色素都可增強茶的品質(zhì)[2]。該菌的代謝產(chǎn)物具有降脂、抗腫瘤細胞活性、促消化等多種功效，菌絲體營養(yǎng)豐富且對人體無毒害[3-7]，常見應用于黑茶[8]的發(fā)酵，目前也見中草藥[9-10]、食品[11-12]發(fā)酵。

小葉苦丁茶是由木犀科女貞屬粗壯女貞(Ligustrumrobustum)的鮮葉經(jīng)殺青、脫水解塊、揉捻、粗烘、二次揉捻、干燥、精制而成，具有多種保健功能[13]，本研究借鑒茯磚茶“散茶發(fā)花”[14]技術(shù)，通過接種冠突散囊菌發(fā)酵苦丁茶，賦予其“菌花香”，減少其苦味和粗青氣，為苦丁茶新產(chǎn)品開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

小葉苦丁茶，由四川省筠連縣冬青御品科技有限公司提供。冠突散囊菌(CICC 2422)，購于中國工業(yè)微生物保藏中心。CZG培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖40，NaCl 50，K2HPO41，NH3NO33，MgSO4·7H2O 0.5。

1.2 實驗方法

1.2.1 液體菌種條件優(yōu)化

以CZG液體培養(yǎng)基為基準培養(yǎng)基，裝液量300 mL/L，28 ℃，120 r/min，培養(yǎng)5 d為基準條件，菌絲干重、菌絲球大小及有性孢子量為評估指標，對蔗糖質(zhì)量分數(shù)(6%、4%、2%)、NaCl質(zhì)量分數(shù)(6%、4%、2%)、pH(4.5、5.5、6.5)采用IBM SPSS Statistics19軟件設計正交實驗。菌絲干重計量方法、菌絲球大小測量方法分別參照文獻[15-16]，有性孢子評估方法為以肉眼評判菌液黃色深淺。

在優(yōu)化后的CZG培養(yǎng)基(蔗糖60 g/L、NaCl 40 g/L、pH 6.5)中，以28 ℃、培養(yǎng)5 d為基礎條件，評估指標同上，圍繞轉(zhuǎn)速(140、120、100 r/min)、接種量(12%、10%、8%)、裝液量(300、250、200 mL/L)采用上述軟件設計正交實驗，優(yōu)化培養(yǎng)條件。

1.2.2 冠突散囊菌發(fā)酵工藝

小葉苦丁茶中加入一定量的無菌水后，70 ℃汽蒸20 min，自然冷卻后取100 g于1 L錐形瓶中，接種10 mL液體菌種，發(fā)酵12 d(前8 d 28 ℃，后4 d 30 ℃)，70 ℃干燥90 min。肉眼評判的菌絲覆蓋度為評估指標，單因子試驗方法先后探究了接種菌齡、茶葉含水量(mL/g)對發(fā)酵的影響。菌齡設定分別為2、3、4、6、8、10 d(含水量為30%)；含水量(質(zhì)量分數(shù))分別設定為20%、 25%、 30%、 35%。

1.2.3 揮發(fā)性物質(zhì)檢測

前處理：0.4 g原葉，發(fā)酵10、12 d的苦丁茶，0.6 g NaCl于20 mL頂空瓶中，加入2 mL沸蒸餾水密封。60 ℃水浴15 min，使用65 μm PDMS/DVB固相微萃取頭頂空吸附60 min，230℃解析5 min進樣，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890A-5975C，Agilent)檢測其揮發(fā)性成分。

色譜柱條件：HP-5MS彈性石英毛細管柱(300 mm×0.25 mm×0.25 μm)分析樣品揮發(fā)性成分，載氣為高純He，流速0.8 mL/min，柱溫40 ℃，保持2 min，以2 ℃/min升至110 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升溫至170 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至260 ℃，保持5 min；進樣溫度300 ℃，接口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃；EI電子能量70 eV，掃描范圍45～350 amu。

1.2.4 茶葉感官審評

組織12位經(jīng)專業(yè)培訓的人員，根據(jù)GB/T 23776—2018，采用輕松感官分析系統(tǒng)，對樣品進行定量描述分析和成對偏愛調(diào)查。

2 結(jié)果與分析

2.1 液體菌種制備工藝優(yōu)化

培養(yǎng)基成分含量和培養(yǎng)條件對冠突散囊菌生長的影響如表1和表2所示。

由表1可知，pH 6.5、蔗糖6%(質(zhì)量分數(shù))、NaCl 4%(質(zhì)量分數(shù))的條件下菌絲體生物量最高，菌液顏色最深，菌絲蓬松，菌絲球大小與其他組合差異不大。由于菌液黃色深淺是有性孢子數(shù)量的直觀呈現(xiàn)[17]，同時菌絲球大小影響菌種接種在物料上的分散度，從而影響發(fā)酵的均勻度，綜合評估，確定該培養(yǎng)基組合為最佳，與其他研究者類似研究[17]結(jié)果相符。在pH 6.5的組合下，菌絲干重、菌液顏色的結(jié)果均優(yōu)于其他組合，可見pH為菌絲體生物量和有性孢子量的主要影響因素。

由表2可知，組合2、4的條件下菌絲體生物量高，菌液顏色最深，菌絲球較小，菌絲狀態(tài)與其他組合一致，但組合4裝液量更少，確定組合2為最佳培養(yǎng)條件。9種組合中，轉(zhuǎn)速相同時，裝液量增加，菌絲球體積趨于增大；裝液量相同時，轉(zhuǎn)速增加，菌液顏色趨于加深，表明菌絲球大小、有性孢子量分別與裝液量、轉(zhuǎn)速呈一定的正相關關系。

表1 培養(yǎng)基成分對冠突散囊菌生長的影響

注：菌絲球大小,“+”表示直徑約1 mm；“++”表示直徑約2 mm；以此類推(下同)

表2 培養(yǎng)條件對冠突散囊菌生長的影響

注：菌液顏色“+”表示不變黃;“++”表示微黃；“+++”表示黃；“++++”表示深黃

2.2 發(fā)酵參數(shù)對冠突散囊菌培養(yǎng)物的影響

茶葉含水量和接種菌齡對冠突散囊菌菌絲生長的影響如圖1和圖2所示。

如圖1所示，當含水質(zhì)量分數(shù)為35%和30%時，延滯期最短，發(fā)酵4和8 d，菌絲覆蓋度分別達到30%和80%以上，10 d即完全覆蓋，周期最短。前者發(fā)酵4 d后，菌絲生長狀況較后者略差，可確定30%含水質(zhì)量分數(shù)為發(fā)酵最佳，低于茯磚茶發(fā)酵所需水分的10%[18]，也進一步說明30%(質(zhì)量分數(shù))左右的水分條件已達到冠突散囊菌生長需求，水含量過高或過低都會影響其生長。從菌絲生長的各階段來看，延滯期最長8 d，最短3 d；進入指數(shù)期后，菌絲覆蓋速率在含水質(zhì)量分數(shù)最佳(30%)與最低(20%)的條件下可分別達到30%/d和10%/d，后者最終不能完全覆蓋，可見水分含量對發(fā)酵的整個階段均有顯著影響。

圖1 水分含量對冠突散囊菌生長的影響

如圖2所示，菌齡為4 d的菌種，接種后延滯期最短，發(fā)酵4和8 d，菌絲覆蓋度分別達到30%和90%，10 d完全覆蓋，周期最短?？纱_定接種菌齡4 d最佳。不同菌齡間延滯期相差最多4 d；菌齡8、10 d的菌種雖最終不能完全覆蓋，但進入指數(shù)期后，其菌絲覆蓋速率在6～8 d略高于短菌齡菌種，可見菌齡主要影響延滯期與發(fā)酵周期。

圖2 菌齡對苦丁茶發(fā)酵的影響

2.3 苦丁茶發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質(zhì)的變化

苦丁茶發(fā)酵過程中揮發(fā)性物質(zhì)種類的變化如圖3，表3～表5所示。

由圖3可知，3個階段的樣品共檢測出58種物質(zhì)，其中苦丁茶原葉26種，發(fā)酵10 d的樣品31種，發(fā)酵12 d的樣品32種。3個樣品共有相同物質(zhì)11種(具體物質(zhì)見表4)，原葉中的8種物質(zhì)消失(具體物質(zhì)見表3)；發(fā)酵10、12 d的樣品分別新增15、18種物質(zhì)，而且這些物質(zhì)僅有3種在2階段同時存在(具體物質(zhì)見表4)；反，順-2,6-壬二烯醛、5-甲基呋喃醛、香葉基丙酮、1-乙酰環(huán)己烯、甲基庚烯酮5種物質(zhì)在原葉、發(fā)酵10 d的樣品中檢出；萜品烯、2,4-二叔丁基苯酚2種物質(zhì)在原葉、發(fā)酵12 d的樣品中檢出。說明苦丁茶接種“金花”菌發(fā)酵及發(fā)酵的過程中揮發(fā)性物質(zhì)發(fā)生了復雜而顯著的變化。

圖3 苦丁茶原葉、發(fā)酵10 d、發(fā)酵12 d的苦丁茶揮發(fā)性物質(zhì)種類

表3 原葉中消失的物質(zhì)

由表4可知，發(fā)酵10和12 d新增兩階段新增物質(zhì)交叉少、基數(shù)小、種類多，而且僅分別有3、4種物質(zhì)從茯磚茶中被檢出[19-23]，表明隨著發(fā)酵的進行，物質(zhì)變化在持續(xù)，物質(zhì)成分與茯磚茶有較大的差異。

由表5可知，發(fā)酵10 d的樣品中檸檬醛、香葉醛為含量最多的2種物質(zhì)，占到了54.05%，相對苦丁茶原葉共增加了24.45%，但在發(fā)酵12 d的樣品中含量則下降為12.55%。發(fā)酵12 d的樣品中桉葉油醇、芳樟醇含量最多，占到了45.21%，相對原葉和發(fā)酵10 d的樣品分別共增加了22.34%和37.91%。這些顯示不同發(fā)酵階段樣品中揮發(fā)性主體物質(zhì)也發(fā)生了巨大的變化。

芳樟醇和癸醛是所有物質(zhì)中隨著發(fā)酵的進行其含量持續(xù)上升的物質(zhì)，其中芳樟醇的變化趨勢與在茯茶發(fā)酵研究[19]的結(jié)果是一致的。甲基庚烯酮在原葉中含量高(7.97%)，在發(fā)酵10 d的樣品中僅為0.93%。從芳樟醇、甲基庚烯酮變化規(guī)律來看，這2種物質(zhì)具備成為生產(chǎn)監(jiān)控指標物質(zhì)的可能性，但需進一步驗證。

表4 發(fā)酵10、12 d新增物質(zhì)

注：—表示未檢測到相應物質(zhì)；*表示茯磚茶中檢出物質(zhì)

表5 三個樣品中相同的揮發(fā)性物質(zhì)

此外，發(fā)酵10、12 d的苦丁茶所呈現(xiàn)出的物質(zhì)差異和感官特征差異均較明顯，綜合前述物質(zhì)比較分析，發(fā)酵10 d可作為一個發(fā)酵節(jié)點，但還需結(jié)合茶湯感官特征、菌體色澤、生產(chǎn)周期確定發(fā)酵周期。

2.4 發(fā)酵苦丁茶的感官評價

發(fā)酵后苦丁茶表面遍布金黃色培養(yǎng)物。從感官評價雷達圖(圖4)可知，發(fā)酵10 d后，感官風味變化明顯，茶湯苦味消失，粗青氣、植物香顯著下降，有菌香和淡淡的甜香，湯色橙黃明亮，滋味醇和，有綿滑感；繼續(xù)發(fā)酵2 d(發(fā)酵12 d)，茶湯感官變化不大。同時，75%的人更喜歡發(fā)酵后的苦丁茶。

綜合發(fā)酵參數(shù)、感官特征和生產(chǎn)效率，確定優(yōu)化后的工藝為蔗糖質(zhì)量分數(shù)6%、NaCl質(zhì)量分數(shù)4%、pH 6.5的CZG培養(yǎng)基(裝液量1/4)，140 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)制備冠突散囊菌液體菌種，培養(yǎng)4 d后接種到70 ℃汽蒸20 min滅菌后的苦丁茶中，調(diào)整含水量為30%，28 ℃發(fā)酵8 d后升溫至30 ℃，繼續(xù)發(fā)酵2 d，70 ℃烘90 min。

圖4 冠突散囊菌對苦丁茶感官風味的影響

3 結(jié)論

本文首次將冠突散囊菌應用于苦丁茶發(fā)酵，發(fā)酵工藝與茯磚茶相比，時間更短，工藝更簡潔[24]；而物料含水量、發(fā)酵溫度等發(fā)酵參數(shù)差異不大[14]，在一定程度上與茯磚茶發(fā)酵的實際工藝研究相吻合。

苦丁茶接種“金花”菌發(fā)酵后，感官特征明顯改善；發(fā)酵過程中，揮發(fā)性物質(zhì)持續(xù)變化，尤其是揮發(fā)性主體物質(zhì)大幅度改變，酮類物質(zhì)減少，酯類物質(zhì)持續(xù)增加。