李國(guó)強(qiáng)，羅平，康佳煒，胡瑞舟，張健*

1(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都， 610039)2(宜賓學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓， 644000)

玉米秸稈含大量粗纖維，總糖，還含有少量蛋白質(zhì)、VD、礦物質(zhì)和脂肪，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的可再生資源[1-3]。國(guó)內(nèi)對(duì)玉米秸稈的利用研究主要集中在生產(chǎn)沼氣、堆肥、還田等方面[4-6]，作為飼料加工的不到10%。因其蛋白含量低、粗纖維含量高等缺點(diǎn)，只能用于反芻動(dòng)物飼養(yǎng)和畜禽的輔助用料[7-8]。能有效地利用秸稈進(jìn)行加工轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的單細(xì)胞蛋白飼料已成為飼料研究熱點(diǎn)。但秸稈結(jié)構(gòu)復(fù)雜難以降解，需通過(guò)預(yù)處理提高降解率。稀酸法在秸稈預(yù)處理中應(yīng)用較多，但會(huì)生成大量不能被多數(shù)微生物利用的木糖，此外生成的酸、酚類(lèi)、醛類(lèi)等物質(zhì)會(huì)抑制微生物發(fā)酵，極大限制了微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化秸稈的效率。目前主要采用混菌發(fā)酵、增加接種量和延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間等方法來(lái)避免發(fā)酵抑制因子對(duì)發(fā)酵造成的不良影響[9]，但存在工藝復(fù)雜、成本高和發(fā)酵周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。因此選育出能利用或耐受發(fā)酵抑制因子和高效利用木糖的菌株對(duì)秸稈飼料化具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

莢膜紅假單胞菌菌體蛋白高(質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%以上)，含胞外免疫多糖、類(lèi)胡蘿卜素、維生素等物質(zhì)[10-12]。廣泛應(yīng)用于凈化水質(zhì)、生物制氫，又因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、綠色安全可作為餌料添加劑，在防止魚(yú)蝦疾病和促進(jìn)生長(zhǎng)等方面表現(xiàn)良好[13-14]，是生產(chǎn)蛋白飼料的理想菌株。但目前尚無(wú)利用莢膜紅假單胞菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化玉米秸稈產(chǎn)單細(xì)胞蛋白飼料的研究報(bào)道。以莢膜紅假單胞菌為出發(fā)菌株篩選出高效利用木糖、苯酚的誘變菌株，提升菌株對(duì)秸稈降解產(chǎn)物的利用率，提高菌體蛋白產(chǎn)量，將秸稈轉(zhuǎn)化為飼料。對(duì)解決我國(guó)飼料源短缺的現(xiàn)狀，減少木質(zhì)纖維原料的浪費(fèi)，降低焚燒秸稈對(duì)環(huán)境帶來(lái)的污染等方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與菌種

采集四川宜賓南溪區(qū)收獲玉米籽實(shí)后的玉米秸稈，剪至5～8 cm，80 ℃烘干，粉碎過(guò)40目篩。

莢膜紅假單胞菌,購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，編號(hào)1.1737。

1.1.2 設(shè)備與儀器

F800纖維測(cè)定儀、SOX500脂肪測(cè)定儀，海能儀器；Kjeltec 8400凱氏定氮儀，F(xiàn)OSS。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基 (g/L)：NaHCO31.0，KH2PO41.0， Na2SO30.1，MgSO4·7H2O 0.01，CaCl20.000 5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001，NH4Cl 1.0，酵母膏1.0，蛋白胨1.0，乙酸鈉5.0，pH 7.0。

選擇培養(yǎng)基：去除種子培養(yǎng)基中的碳源，以木糖或苯酚為唯一碳源。

以上培養(yǎng)基使用前121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 誘變與選育

誘變參照文獻(xiàn)[15-16]。

將經(jīng)誘變后的菌液誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后，吸取0.1 mL稀釋液涂布相應(yīng)選擇培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24～72 h。挑取長(zhǎng)勢(shì)好的菌落，劃線純化，連續(xù)傳代10次后保存。

1.2.2 試驗(yàn)流程

原料預(yù)處理：稱取100 g玉米秸稈用0.75%稀H2SO4調(diào)整固液比為1∶5后轉(zhuǎn)至1.5 L不銹鋼管式反應(yīng)器中150 ℃酸化1 h，得酸化糟，隨后加入10 mL濃氨水100 ℃處理2 h，得氨化糟，加0.8%(體積分?jǐn)?shù))氨水調(diào)節(jié)pH到5.0，加纖維素酶至200 U/g 物料，50 ℃，120 r/min搖床水解72 h得酶處理糟。

發(fā)酵劑制備：采用三級(jí)培養(yǎng)工藝，將1.2.1節(jié)保存的菌株按2.4×109個(gè)/mL接種量接種于酶處理糟中，28 ℃培養(yǎng)5 d，為一級(jí)培養(yǎng)。一級(jí)培養(yǎng)后的菌液按1.5×109個(gè)/mL接種于酶處理糟中，培養(yǎng)條件不變，為二級(jí)培養(yǎng)，以二級(jí)培養(yǎng)后的菌液按6×108個(gè)/mL接種于酶處理糟中為三級(jí)培養(yǎng)，以三級(jí)培養(yǎng)液作為發(fā)酵劑。

接種發(fā)酵：酶處理糟按一定接種量接種誘變菌株發(fā)酵劑，加入無(wú)菌水，控制一定的料水比，在適宜的溫度、搖床轉(zhuǎn)速、糟層厚度條件下發(fā)酵數(shù)天，每日用0.8 %(體積分?jǐn)?shù))的氨水調(diào)整pH為7.0。烘干測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.3 研究?jī)?nèi)容

誘變劑對(duì)誘變菌株的影響。以0、0.5%、1%、1.5%、2%和3%甲基環(huán)酸乙酯以及0、20、40、60、80 和120 s紫外線照射時(shí)間誘變莢膜紅假單胞菌，按公式(1)計(jì)算致死率：

(1)

式中：m，空白對(duì)照組菌落數(shù)；n，誘變后再生菌落數(shù)。

誘變菌去除苯酚和木糖能力測(cè)試。1.2.1中保存的菌株按3×107個(gè)/mL接種量于100 mL以木糖、苯酚為唯一碳源的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，測(cè)定接種0、24、48、72 h后計(jì)算誘變菌株對(duì)木糖、苯酚的去除率，按公式(2)計(jì)算去除率：

(2)

式中：R，苯酚或木糖去除率，%；m0，接種前培養(yǎng)液苯酚或木糖含量，mg；m1，接種一段時(shí)間后培養(yǎng)液中苯酚或木糖含量，mg。

單因素實(shí)驗(yàn)。按1.2.2流程所示，在黑暗件下以溫度(27、28、29、30、31、32 ℃)、發(fā)酵時(shí)間(2、3、4、5、6、7 d)、接種量(3%、5%、7%、9%、11%、13%)、糟層厚度(1、2、3、4、5、6 cm)、搖床轉(zhuǎn)速(100、110、120、130、140、150 r/min)、料水比(g∶g)(1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13)6個(gè)因素，每個(gè)因素6個(gè)水平做單因素試驗(yàn)。測(cè)定粗纖維素和真蛋白質(zhì)因發(fā)酵條件變化引起的含量變化。

3.2 地草地螟、蚜蟲(chóng)防治：用20%殺滅菊酯乳油2000倍液～3000倍液，或2.5%敵殺死乳油倍液2500倍液～3000倍液，或2.5%功夫乳油2500倍液～3000倍液均勻噴霧。

正交試驗(yàn)。根據(jù)1.2.3中選取6因素最佳工藝參數(shù)作為參考，選取溫度(29、30、31 ℃)、發(fā)酵時(shí)間(4、5、6 d)、接種量(8、10、12%)、糟層厚度(3.5、4.0、4.5 cm)、搖床轉(zhuǎn)速(110、120、130 r/min)、料水比(1∶8、1∶9、1∶10)進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化。以最佳條件組合重做驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)定樣品指標(biāo)。

1.2.4 分析方法

木糖、苯酚含量測(cè)定分別參照管斌等[17]、GAO等[18]的實(shí)驗(yàn)方法。白酒丟糟與發(fā)酵干糟真蛋白含量測(cè)定參照沉淀法[19]與凱氏定氮法[20]；菌落計(jì)數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法，丟糟與發(fā)酵干糟粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、粗纖維、水分測(cè)定分別按“中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)”GB/T 6432—94、GB/T 6433—2006、GB/T 6438—2007、GB/T 6434—2006、GB/T 6435—2006執(zhí)行，作圖、正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及顯著性分析分別用Excel 2010和SPSS 21.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變劑對(duì)菌株的影響

不同濃度的甲基環(huán)酸乙酯致死率分別為0、10.63%、36.87%、52.43%、75.27%和99.43%。不同紫外線照射時(shí)間的致死率分別為0、3.67%、19.12%、48.67%、88%和100%。選擇致死率在50%左右的誘變劑量誘變，即1.5%甲基磺酸乙酯、紫外線照射60 s進(jìn)行復(fù)合誘變，篩選獲得1株菌落直徑大，長(zhǎng)勢(shì)好的菌株記為FJM。

2.2 誘變菌株木糖、苯酚利用率測(cè)定

由表1可知，JM在接種72 h后對(duì)木糖去除率為92.54%，菌株FJM對(duì)木糖的去除率較原菌株有小幅提升。JM和FJM接種24 h后對(duì)400 mg/L苯酚去除率分別為5.53%和89.87%，當(dāng)苯酚質(zhì)量濃度達(dá)600 mg/L接種72 h后苯酚去除率分別為5.28%和97.73%，F(xiàn)JM菌株相較原菌株顯示其高濃度耐受和高除去率的優(yōu)勢(shì)。當(dāng)苯酚質(zhì)量濃度達(dá)到800 mg/L時(shí)誘變菌株和原菌株均達(dá)到抑菌濃度。

表1 誘變菌株與原菌種對(duì)木糖和苯酚利用率測(cè)定結(jié)果

注：JM為莢膜紅假單胞菌，F(xiàn)JM為誘變的莢膜紅假單胞菌突變菌株

2.3 單因素試驗(yàn)

如圖1所示，發(fā)酵2～5 d真蛋白含量顯著(P<0.05)上升達(dá)18.46%，粗纖維顯著下降(P<0.05)至15.51%。之后隨著發(fā)酵延續(xù)，發(fā)酵液達(dá)最大生物濃度，真蛋白和粗纖維含量變化不明顯(P>0.05)。

如圖2所示，27～30 ℃真蛋白含量隨發(fā)酵溫度提升而提高(P<0.05)，達(dá)18.56%，粗纖維顯著下降(P<0.05)至15.51%。之后隨著發(fā)酵溫度的繼續(xù)提升，光合細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制，真蛋白含量逐漸下降。粗纖維含量隨著發(fā)酵溫度的上升逐漸下降，當(dāng)溫度到達(dá)31℃后粗纖維含量無(wú)明顯變化(P>0.05)。隨著溫度的繼續(xù)上升菌株生長(zhǎng)受到抑制。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)秸稈真蛋白和粗纖維含量的影響

如圖3所示，接種量為1.5×108～3.3×108個(gè)/mL時(shí)接種量小，菌體基數(shù)小增長(zhǎng)慢，真蛋白含量隨接種量的增加含量逐步提升(P<0.05)，之后繼續(xù)增加接種量，菌體增長(zhǎng)達(dá)最大，真蛋白含量提升不明顯(P>0.05)。接種量對(duì)發(fā)酵糟粗纖維含量影響較小(P>0.05)。

圖3 接種量對(duì)秸稈真蛋白和粗纖維含量的影響

如圖4所示，料水比值為1∶8～1∶10時(shí)，正蛋白明顯上升(P<0.05)，料水比值繼續(xù)增大時(shí)真蛋白含量明顯下降(P<0.05)。當(dāng)料水比值低時(shí)，發(fā)酵液含水含量低、溶氧量低不利于光合細(xì)菌生長(zhǎng)。當(dāng)料水比值高時(shí)，發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度低同樣不利于光合細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。粗纖維含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。

圖4 料水比對(duì)秸稈真蛋白和粗纖維含量的影響

如圖5所示，隨糟層厚度的增加真蛋白含量呈先上升后下降的趨勢(shì)(P<0.05)，粗纖維呈先下降后上升的趨勢(shì)(P<0.05)。當(dāng)糟層較薄時(shí)振蕩劇烈，影響菌體生長(zhǎng)，當(dāng)糟層較厚時(shí)振蕩程度減弱，溶氧量減少，不利于菌株的避光好氧生長(zhǎng)。

圖5 糟層厚度對(duì)秸稈真蛋白和粗纖維含量的影響

如圖6所示，真蛋白含量隨搖床轉(zhuǎn)速的提升呈先上升后下降的趨勢(shì)(P<0.05)，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速低時(shí)，發(fā)酵液中溶氧量低，限制了菌株的避光好氧生長(zhǎng)。粗纖維含量隨搖床轉(zhuǎn)速的升高呈先下降后上升的趨勢(shì)。

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)秸稈真蛋白和粗纖維含量的影響

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2發(fā)酵正交試驗(yàn)，各因素水平的均值和極差可知，最佳條件組合為糟層厚度4.5 cm、接種量8%、料水比值10、搖床轉(zhuǎn)速120 r/min、發(fā)酵溫度31 ℃、發(fā)酵時(shí)間6 d；因素對(duì)發(fā)酵糟真蛋白含量影響為搖床轉(zhuǎn)速(2.52)>發(fā)酵溫度(1.94)>糟層厚度(1.48)>發(fā)酵時(shí)間(0.92)>接種量(0.64)>料水比(0.36)，按以上正交試驗(yàn)的最佳組合，重新接種發(fā)酵3 次，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)后對(duì)比發(fā)酵前玉米秸稈及原菌種發(fā)酵糟物質(zhì)含量。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

注：料水比為方便展示，上表以值的方式顯示,即料水比1∶8顯示為8

由表3可知，營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)比可見(jiàn)，在高溫、酸性條件下秸稈纖維結(jié)構(gòu)被破壞，秸稈中超過(guò)80%半纖維素，少部分纖維素和木質(zhì)素降解[21]，之后加酶水解，粗纖維降低20.76%，灰分上升0.12%。之后加氨水中和使粗蛋白上升2.71%。接種夾膜紅假單胞菌發(fā)酵后粗蛋白上升15.6%、真蛋白上升13.62%、粗脂肪上升1.2%、因無(wú)機(jī)鹽離子被消耗灰分下降0.44%。接種誘變菌株FJM發(fā)酵后粗蛋白上升18.72%、真蛋白上升18.85%、粗脂肪上升1.82%、灰分降低0.49%，發(fā)酵糟的含水率為9.97%，顯著提了高玉米秸稈飼用價(jià)值。

表3 預(yù)處理前后玉米秸稈與不同發(fā)酵糟的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)比

3 討論

近年，利用工農(nóng)業(yè)廢棄物生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的研究已相繼報(bào)道[22-23]，季彬等[24]用綠色木霉發(fā)酵玉米秸稈，使粗蛋白上升至17.3%，粗纖維下降至19.6%，但粗蛋白含量低，粗纖維含量高，達(dá)不到飼用要求。張阿強(qiáng)[25]用黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母混菌分步發(fā)酵玉米秸稈，發(fā)酵結(jié)束后粗蛋白和真蛋白含量分別為30.93%和16.2%，雖粗蛋白上升較大但真蛋白含量較低，飼用價(jià)值較低。

莢膜紅假單胞菌是一種對(duì)魚(yú)蝦有益、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、綠色安全的微生物，在單細(xì)胞蛋白飼料生產(chǎn)中具有極大的潛力[26]。前人研究結(jié)果表明莢膜紅假單胞菌能利用葡萄糖，但不能利用五碳糖和酚類(lèi)。本試驗(yàn)獲得的能高效利用木糖和苯酚的菌株FJM，能有效利用玉米秸稈降解的第二大產(chǎn)物五碳糖和稀酸預(yù)處理產(chǎn)生的酚類(lèi)物質(zhì)。充分利用玉米秸稈的降解產(chǎn)物供自身生長(zhǎng)繁殖而不受發(fā)酵抑制因子的影響，從而將玉米秸稈降解產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，因此使玉米秸稈真蛋白含量從5.02%提升至23.87%。發(fā)酵結(jié)果顯示，粗蛋白含量提升至32.37%，高于邱宏端等[27]以莢膜紅假單胞菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化醬渣，使粗蛋白提升至22.7%的研究。真蛋白含量提升374%，高于ZHANG等[28]用深紅紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)發(fā)酵經(jīng)預(yù)處理后的稻草秸稈，發(fā)酵后真蛋白含量提升286%的研究。曾宇等[29]利用嗜酸紅假單胞菌(Rhodospirillumacidophila)和類(lèi)球紅細(xì)菌(Rhodospirillumsphaeroides)發(fā)酵氨化預(yù)處理的玉米秸稈，實(shí)現(xiàn)了利用光合菌轉(zhuǎn)化玉米秸稈的目的，但存在纖維素含量高、蛋白質(zhì)含量低等缺點(diǎn)。鑒此，采用誘變菌株FJM發(fā)酵經(jīng)稀酸、氨化、酶解3種方法聯(lián)合處理后的玉米秸稈，使秸稈粗纖維降低61.5%。較前人研究粗蛋白、真蛋白提升更大，粗纖維含量更低，此外，還較低水平提高粗脂肪，降低粗灰分。顯示出誘變菌株FJM對(duì)玉米秸稈飼料化的顯著優(yōu)勢(shì)。但該菌株自身不能利用木質(zhì)纖維原料中的粗纖維組分，致使原料預(yù)處理存在工藝復(fù)雜，消耗大量的人力物力，成本較高等缺點(diǎn)。因此如何篩選出既能高效降解玉米秸稈粗纖維組分，自身又富含蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且營(yíng)養(yǎng)需求低的微生物是未來(lái)秸稈飼料化研究的主要方向。