桑勝旺，簡玉英，李浠源，何鑫，錢鄧帆，王彩霞，李誠，李樹紅，李美良

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安， 625014)

臘魚獨(dú)特的品質(zhì)與其在發(fā)酵過程中脂肪的水解、氧化密不可分[1-2]。脂肪酶是水解脂肪的關(guān)鍵酶類，其水解脂肪后生成的游離脂肪酸(free fatty acid, FFA)是脂肪氧化的基礎(chǔ)。脂肪氧化形成的過氧化物再經(jīng)一系列復(fù)雜反應(yīng)，生成了大量的風(fēng)味物質(zhì)，形成了發(fā)酵臘魚特有的風(fēng)味，同時(shí)也改變了產(chǎn)品的營養(yǎng)、色澤[3-4]。臘魚發(fā)酵，脂肪酶的來源主要有兩條途徑，內(nèi)源酶和微生物產(chǎn)酶[5-6]。由于內(nèi)源酶和微生物產(chǎn)酶的數(shù)量有限，可以考慮在臘魚發(fā)酵過程中適當(dāng)添加外源脂肪酶，以達(dá)到改善品質(zhì)的目的。

外源脂肪酶在加速發(fā)酵肉制品成熟、改善產(chǎn)品品質(zhì)方面得到了應(yīng)用并取得了較好的效果：LIU等[7]研究發(fā)現(xiàn)外源脂肪酶可顯著增加發(fā)酵香腸中FFA含量，加速發(fā)酵進(jìn)程，改善產(chǎn)品品質(zhì)；甘春生等[8]向豬后腿注射脂肪酶，生產(chǎn)具有金華火腿風(fēng)味的火腿片；吳若娜[9]在臘鴨腿的制作過程加入脂肪酶，不僅縮短了成熟時(shí)間，還產(chǎn)生了更多風(fēng)味物質(zhì)。目前，有關(guān)外源脂肪酶調(diào)控臘魚發(fā)酵進(jìn)程，改善發(fā)酵臘魚品質(zhì)的研究尚鮮有報(bào)道。本研究以期為人工發(fā)酵臘魚的品質(zhì)改善提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活白鰱(1.25±0.25) kg、生姜、八角、花椒等，購于雅安市蒼坪山農(nóng)貿(mào)市場；LVK-F100脂肪酶(22 000 U)，深圳市綠微康生物工程有限公司；試劑(三氯甲烷、甲醇、石油醚等)，成都科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HHWS-Ⅱ-200恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；TA. XTPIus物性分析儀，Stable Micro System公司；NR10QC手持式色差儀，深圳市三恩馳科技有限公司； pHS-3C型精密pH計(jì)，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種制備

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum, Lp-145)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus， Sx-135)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae， Sc-31)，均從中國傳統(tǒng)的發(fā)酵酸魚中分離得到，由江南大學(xué)食品學(xué)院惠贈。將培養(yǎng)好的菌種經(jīng)離心(8 000 r/min、4 ℃、15 min)，生理鹽水(0.9%)懸浮洗菌后，調(diào)整菌液濃度至107～108CFU/mL備用。

1.3.2 臘魚的制作工藝

將鰱魚前處理后切成長、寬、厚為(5±0.2)cm×(5±0.2)cm×(2±0.2)cm的魚塊；以魚肉質(zhì)量為基準(zhǔn)，食鹽3.5%、葡萄糖3%、生姜片12%、花椒1.2%、八角0.12%、三氯蔗糖0.02%、水200%煮制發(fā)酵液；魚肉與發(fā)酵液裝壇后接入發(fā)酵劑，接入量為1%，接入比例為1∶1∶1[10]；發(fā)酵期間加入外源脂肪酶，發(fā)酵3 d；發(fā)酵結(jié)束后清水清洗魚肉并在魚肉表面涂抹與發(fā)酵階段相同的菌種，30 ℃鼓風(fēng)干燥3 h后，在15 ℃、濕度70%的條件下成熟5 d。

1.3.3 單因素及響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以發(fā)酵后魚肉FFA含量和pH，成熟后產(chǎn)品白度、質(zhì)構(gòu)和感官為指標(biāo)，考察發(fā)酵溫度(14、17、20、23、26 ℃)、脂肪酶添加量(0.00%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.1%)、脂肪酶添加時(shí)間(0、12、24、36、48 h)3個(gè)因素對臘魚品質(zhì)的影響。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken模型，以感官評價(jià)為響應(yīng)值優(yōu)化工藝條件。

1.3.4 FFA含量測定

參考GB 5009.229—2016測定[11]。

1.3.5 魚肉pH值的測定

精確稱取 5 g 魚肉于器皿中，加 50 mL 蒸餾水，高速均質(zhì) 1 min后用 pH計(jì)測定。

1.3.6 白度值測定

色差儀測定，利用公式(1)計(jì)算產(chǎn)品白度。

白度=100-[(100-L*)2+(a*)2+(b*)2]1/2

(1)

式中：L*，亮度；a*，紅度；b*，黃度。

1.3.7 質(zhì)構(gòu)測定

TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)儀，P/5圓柱形探頭，選取魚中線以上距頭部6 cm處，發(fā)酵、成熟后表面平整的魚塊，切成2 cm×2 cm×2 cm的形狀，魚皮側(cè)緊挨載物臺放置，進(jìn)行測定。測定條件：測試模式TPA；測前速度1 mm/s，測試速度1 mm/s，測后速度1 mm/s，壓縮程度為40%，停留間隔5 s，負(fù)重5 g[12]。

1.3.8 感官評定

感官評定由10名食品專業(yè)人員組成的感官評定小組完成，具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析，運(yùn)用SPSS 19.0 軟件Duncan法進(jìn)行顯著性分析，圖表中不同的上標(biāo)字母表示差異顯著(P<0.05)。

表1 發(fā)酵臘魚感官品質(zhì)評分標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵溫度對臘魚品質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度過高，菌種生長過快容易使產(chǎn)品發(fā)酵過度，同時(shí)pH迅速下降也會抑制外源脂肪酶的活性；溫度過低，不僅微生物生長緩慢，外源脂肪酶的活性也被抑制。如圖1-A所示，在14～23 ℃，臘魚中的FFA含量隨溫度升高顯著增加，pH下降；而23～26 ℃時(shí)，臘魚FFA含量僅略微增加，pH上升，其原因可能是發(fā)酵溫度過高，菌種前期快速繁殖，消耗發(fā)酵液中大量營養(yǎng)成分，而后期營養(yǎng)成分減少、發(fā)酵副產(chǎn)物增多，影響發(fā)酵菌種的生長速度，此外，發(fā)酵后期產(chǎn)生的含氮堿性物質(zhì)也會中和乳酸。此結(jié)果與王鶴霖等[13]對魯氏酵母發(fā)酵香腸加工工藝的研究結(jié)論基本一致。許多學(xué)者提出，對于發(fā)酵魚制品，pH在降至4.6以下時(shí)可保證產(chǎn)品的安全性[14-16]，本研究中，20 ℃和23 ℃發(fā)酵均能達(dá)到這一要求。臘魚在成熟過程中，F(xiàn)FA氧化和魚肉本身的非酶促褐變會導(dǎo)致魚體表面顏色由白色向金黃色轉(zhuǎn)變，白度降低[17-18]，發(fā)酵過程中脂肪和蛋白質(zhì)的分解會影響產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)[19]。如圖1-B所示，發(fā)酵臘魚的白度隨溫度的升高顯著降低，質(zhì)構(gòu)也發(fā)生了明顯變化(表2)。整體感官評分隨發(fā)酵溫度的升高呈先上升后下降的趨勢20 ℃條件下發(fā)酵的臘魚感官評分最高(圖1-C)，此時(shí)產(chǎn)品肌肉表層為淡臘黃色、肌肉內(nèi)部呈白色，臘香氣柔和濃郁，腌臘滋味明顯，肉質(zhì)緊實(shí)。

A-FFA及pH； B-白度； C-感官評分

表2 發(fā)酵溫度對發(fā)酵臘魚質(zhì)構(gòu)的影響

注：同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 外源脂肪酶加入量對臘魚品質(zhì)的影響

外源脂肪酶加入量低，臘魚品質(zhì)改善不明顯，加入量過高，魚肉脂肪水解速度快，后期容易氧化過度。如圖2-A所示，隨著脂肪酶加入量的遞增，發(fā)酵后魚肉中的FFA含量先增加后減少，pH值呈先下降后上升的趨勢。酶添加量超過0.04%，臘魚的FFA下降，其原因可能是：底物濃度不變的情況下，酶量的增加對脂肪水解程度提升是有限的[20]，而如果酶添加量過高，水解脂肪生成FFA的速度過快，F(xiàn)FA參與脂肪氧化的速度也越快，大量的FFA參與到脂肪氧化進(jìn)程中，生成醛、酮和酯類等物質(zhì)而被消耗，因此含量降低。臘魚產(chǎn)品的白度隨脂肪酶加入量的增加整體呈下降趨勢(圖2-B)，質(zhì)構(gòu)變化不明顯(表3)。加入脂肪酶后產(chǎn)品的香氣和滋味均發(fā)生改變，當(dāng)酶的加入量為0.04%時(shí)產(chǎn)品的感官總評分顯著高于其他組(圖2-C)，此時(shí)產(chǎn)品為淡臘黃色，臘香味特征明顯，口感濃郁。

A-FFA及pH； B-白度； C-感官評分

表3 脂肪酶添加量對發(fā)酵臘魚質(zhì)構(gòu)的影響

2.1.3 脂肪酶加入時(shí)間對臘魚的影響

在接入發(fā)酵劑后的0～48 h選擇不同時(shí)間加入脂肪酶，探究脂肪酶的加入時(shí)間對臘魚品質(zhì)的影響。將發(fā)酵劑和脂肪酶同時(shí)接入(0 h)，此時(shí)乳酸菌還未大量繁殖，魚肉pH相對較高，適宜脂肪酶的活動，且脂肪酶作用于整個(gè)發(fā)酵過程，作用時(shí)間長，生成的FFA多，pH低；隨著加酶時(shí)間的不斷滯后，前期加入的乳酸菌產(chǎn)酸導(dǎo)致發(fā)酵體系pH降低，抑制了脂肪酶活性，加之酶作用時(shí)間縮短，因此發(fā)酵臘魚中的FFA含量逐漸降低，pH逐漸升高(圖3-A)。雖然加入脂肪酶的目的是加速脂肪水解，為脂肪的氧化及風(fēng)味物質(zhì)的合成提供物質(zhì)基礎(chǔ)[21]，但脂肪的過度水解會導(dǎo)致產(chǎn)品酸價(jià)過高，氧化過度而影響產(chǎn)品品質(zhì)，甚至可能帶來食品安全問題[22-23]，因此FFA的生成量應(yīng)適度。脂肪酶的加入時(shí)間對發(fā)酵臘魚的質(zhì)構(gòu)影響并不顯著(表4)。脂肪酶的作用時(shí)間越長，臘魚的白度越低(圖3-B)。一般來講，顏色越深，說明氧化程度越高[24]，過高會影響產(chǎn)品的口感。感官評價(jià)的結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)，發(fā)酵0 h加入脂肪酶的產(chǎn)品口感不佳，哈喇味明顯，評價(jià)者認(rèn)為發(fā)酵24 h后再加入脂肪酶感官最好(圖3-C)。

A-FFA及pH； B-白度； C-感官評分

表4 脂肪酶加入時(shí)間對發(fā)酵臘魚質(zhì)構(gòu)的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 模型檢驗(yàn)方差分析

對發(fā)酵溫度、脂肪酶添加量及脂肪酶添加時(shí)間的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果如表5所示，方差分析結(jié)果如表6所示。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表6 響應(yīng)面回歸模型方差分析

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)

2.2.2 響應(yīng)面交互效應(yīng)分析

由圖4可知，當(dāng)固定加酶時(shí)間取零點(diǎn)時(shí)，發(fā)酵溫度和加酶量兩者之間交互作用的等高線為橢圓形，交互作用顯著，分別固定發(fā)酵溫度和加酶量，感官評分隨著加酶量和發(fā)酵溫度均先增加后減小，說明控制好發(fā)酵溫度與加酶量對產(chǎn)品的感官至關(guān)重要，這與回歸方程的方差分析結(jié)果一致。

A-響應(yīng)面圖；B-等高線圖

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果確定外源脂肪酶輔助發(fā)酵臘魚的最佳工藝參數(shù)為發(fā)酵溫度19.37 ℃，加酶量0.04%，加酶時(shí)間發(fā)酵后27.31 h，在該條件下發(fā)酵鰱魚的感官評分可達(dá)到88.06±6.1。實(shí)際操作調(diào)整為發(fā)酵溫度20 ℃，加酶量0.04%，加酶時(shí)間為發(fā)酵后27 h，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得發(fā)酵臘魚感官評分為88.9±6.6(圖5)，與模型預(yù)測感官評分十分接近，說明用響應(yīng)面法優(yōu)選的條件可靠。

圖5 驗(yàn)證試驗(yàn)感官評價(jià)結(jié)果

3 結(jié)論

鰱魚接入發(fā)酵劑在20 ℃下發(fā)酵27 h后加入0.04%(以魚肉計(jì))的外源脂肪酶，繼續(xù)在20 ℃下發(fā)酵45 h，之后經(jīng)沖洗、烘干(30 ℃，3 h)、成熟(15 ℃，5 d)得到最終產(chǎn)品。加酶后，發(fā)酵臘魚塊的色澤、口感和風(fēng)味與未加酶組相比均有明顯改善，說明加入外源脂肪酶能有效改善發(fā)酵臘魚的產(chǎn)品品質(zhì)。