董 昕 白景妙 吳海燕

(1. 品測〔上海〕檢測科技有限公司，上海 201108；2. 山東美正生物科技有限公司，山東 青島 266000；3. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266000)

貝類毒素亦稱赤潮生物毒素，是由有害赤潮生物產(chǎn)生的天然活性物質(zhì)。赤潮是在特定的環(huán)境下，海水中原生生物、浮游生物或細菌爆發(fā)性增殖造成水體變色的生態(tài)現(xiàn)象。在5 000多種海洋微藻中，可以形成赤潮的微藻至少有180種，其中有毒的藻類占據(jù)近1/2，已被證實含有毒素或者能夠分泌毒素的有30～40種[1]。因研究人員最早從貝類體內(nèi)發(fā)現(xiàn)赤潮毒素，故稱此類毒素為貝類毒素。赤潮毒素隨著濾食性魚、蝦、貝類的濾食活動被富集在體內(nèi)，造成海產(chǎn)品毒化。毒化的海產(chǎn)品通過食物鏈的傳遞最終導致人體中毒。

神經(jīng)性貝類毒素(Neurotoxic Shellfish Poisoning，NSP)是由短裸甲藻、劇毒岡比甲藻等藻類在細胞裂解、死亡時會釋放出一組效力較大的神經(jīng)毒素。高濃度的神經(jīng)毒素很容易造成魚類的大批量死亡，相反牡蠣、蛤類和貽貝對該毒素不敏感，外表上完全呈現(xiàn)出健康狀態(tài)[2]。神經(jīng)性貝類毒素是一類脂溶性環(huán)狀聚醚類毒素，可造成誤食者神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道不適，引發(fā)惡心、嘔吐、腹瀉、痙攣、支氣管收縮、麻痹、抽搐和昏迷等癥狀。其中短裸甲藻毒素(Brevetoxin，BTX)是主要的一類毒素成分，主要由裸甲藻、海洋卡盾藻和赤潮異彎藻產(chǎn)生，其基本結(jié)構(gòu)分為A型(BTX-A，即PbTx-A)和B型(BTX-B，即PbTx-B)，包含數(shù)十種衍生物，以BTX-2(即PbTX-2)最為常見[3-4]。

目前美國、澳大利亞和新西蘭等國家規(guī)定小鼠生物法安全標準為20 MUs/100 g，相當于800 μg PbTX-2/kg貝肉組織[5]，而中國尚無針對此類毒素的限量標準，一般針對此類毒素的限量值是參考歐美限量。

國際上普遍采用小鼠生物法、免疫分析法、細胞毒性檢測法及理化分析方法等手段來檢測貝類并作出預警預報[6-10]。小鼠生物法是檢測貝類毒素發(fā)展最早、應用最廣泛的分析方法，但存在靈敏度差、步驟繁瑣、無法確定毒素組分、重復性差(不同批次、不同品系小鼠)、易導致假陽性結(jié)果等問題。酶聯(lián)免疫法雖檢測時間短、成本低，但易受交叉反應的影響而出現(xiàn)假陽性或者假陰性的問題。液相色譜法需要復雜的前處理，且缺乏準確的定性能力。液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了液相色譜優(yōu)越的分離能力與質(zhì)譜高靈敏度的定性定量功能，應用越來越廣泛。但市場上存在的一些固相萃取柱產(chǎn)品，回收率低、樣品基質(zhì)干擾仍較嚴重，大大降低了方法的應用率[11-13]。免疫親和柱(immunoaffinity column，IAC)是一種基于抗原抗體反應的新型層析柱，可選擇性吸附樣品提取液中的目標化合物，在特異性富集毒素的同時凈化樣品基質(zhì)，凈化效果好。作為新型高效的前處理凈化技術(shù)，免疫親和柱凈化技術(shù)正在不斷改進發(fā)展，在生物毒素檢測領(lǐng)域應用越來越廣泛[14-16]。

試驗擬以PbTX-2為研究對象，研制NSP免疫親和柱的裝柱，并建立NSP的免疫親和柱凈化—液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，以期經(jīng)免疫親和柱凈化的樣品提取液可直接用于LC-MS/MS分析，達到快速檢測和提高檢測方法靈敏度、準確性的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貽貝、蛤蜊、牡蠣、扇貝樣品：市售；

PbTX-2標準品：純度99.5%，美國LKT LABS公司；

甲酸、甲酸銨：色譜純，美國Sigma公司；

甲醇、乙腈：色譜純，德國Merck公司；

十二水合磷酸氫二鈉、氯化鈉、鹽酸、碳酸氫鈉、二水合磷酸二氫鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒：賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

瓊脂糖凝膠：上海通用電器有限公司；

0.22 μm有機微孔濾膜：上海安普科學儀器有限公司；

試驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

液相色譜—四極桿/離子阱復合質(zhì)譜：AB 5500 QTrap型，美國SCIEX公司;

純水儀：MILLI-Q型，美國Millipore公司；

分析天平：ME204型，瑞士梅特勒—托利多公司；

旋窩振蕩器：Talboys型，美國Talboys公司；

高速離心機:Himac CR 22G II型，日立Hitachi公司；

氣控操作架:HM09004-1型，北京美正生物科技有限公司。

1.3 NSP免疫親和柱的制備

1.3.1 PbTX-2單克隆抗體制備 采用動物體內(nèi)誘生單克隆抗體法合成PbTX-2全抗原對小鼠進行免疫，取小鼠脾細胞和骨髓瘤細胞Sp2/0進行融合，篩選出特異性強、靈敏度高、能分泌抗PbTX-2的單克隆抗體細胞株，通過液體石蠟注射到小鼠腹腔內(nèi)致命，然后將分泌抗PbTX-2的細胞接種到小鼠體內(nèi)，制備抗PbTX-2的單克隆抗體腹水。使用Protein G柱進行抗體純化[17]。

1.3.2 PbTX-2抗體蛋白濃度測定 將PbTX-2抗體溶液用BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒進行蛋白濃度測定。測得該PbTX-2抗體溶液蛋白濃度為2 mg/mL。

1.3.3 NSP免疫親和柱的制備 將純化后的PbTX-2抗體加入處理好的Sepharose CL 4B凝膠中[18]，具體步驟：

(1) 凝膠制備：將2 g溴化氫活化的Sepharose CL 4B 干粉加入到25 mL 1 mmol/L的HCl溶液中溶脹，將膠轉(zhuǎn)入砂芯漏斗中，然后用200 mL 1 mmol/L的HCl清洗，再用200 mL反應緩沖液(0.1 mol/L碳酸氫鈉)清洗充分。

(2) 偶聯(lián)：清洗完后抽干，將膠加入10 mL含有0.5 mg/mL PbTX-2的抗體偶聯(lián)緩沖液溶液中，室溫溫和攪拌2 h或過夜反應，反應完成后靜置，收集上清，BCA法測定上清液中未偶聯(lián)蛋白含量，按式(1)計算偶聯(lián)率，經(jīng)測定制備的NSP抗體與凝膠的偶聯(lián)率為100%。

(1)

式中：

p——偶聯(lián)率，%；

m1——偶聯(lián)前抗體總量，mg；

m2——未偶聯(lián)抗體總量，mg。

(3) 洗滌：用反應緩沖液洗滌反應后的膠，將膠加入15 mL Tris-HCl (0.1 mol/L，pH 8.0)緩沖液中，室溫下溫和攪拌2 h。用600 mL 0.1 mol/L醋酸緩沖液(pH 4.5)和Tris-HCl先后交替進行洗滌4～6次。

(4) 裝柱：洗滌后的凝膠用250 mL PBS充分平衡后裝柱，取3 mL空柱管壓好底部篩板，然后將膠平均裝到10支3 mL柱管中，堵好上下堵頭，做好標識，儲存于2～8 ℃。每根柱凝膠體積為0.5 mL，相當于每根柱含有0.3 mg NSP抗體。

1.3.4 NSP免疫親和柱的柱容量驗證 為了評價自制NSP免疫親和柱的效果，通過不同上樣量的回收試驗，測試自制柱的柱容量。分別移取1 mL濃度為200，400，1 000，1 600 ng/mL的PbTX-2標準溶液與20 mL PBS溶液混合均勻，全部添加到制備的免疫親和柱上，以1 mL/min的流速流出，然后用6 mL 20%甲醇水溶液淋洗免疫親和柱，流速2～3滴/s，流干柱內(nèi)殘留液，并棄去以上全部流出液。最后用3 mL甲醇洗脫，流速1滴/s，收集洗脫液，室溫中氮吹至小于1 mL，用甲醇補至1 mL。混勻后用0.22 μm有機微孔濾膜過濾后進行檢測。計算柱容量，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 PbTX-2上樣量與回收率

由表1可知，自制免疫親和柱的上樣量在1 000 ng以下回收率均達到90%以上，而上樣量在1 000 ng以上時，回收率下降。因此自制免疫親和柱的最大柱容量為1 000 ng。

1.4 NSP免疫親和柱的應用

1.4.1 NSP標準溶液的配制 稱取一定量的PbTX-2粉末，用純甲醇稀釋至1 mg/mL，-18 ℃避光保存，有效期1年。根據(jù)PbTX-2在LC-MS/MS上響應值和線性相關(guān)性，將母液稀釋濃度為5，10，20，50，100，200，500 ng/mL的標準工作溶液。

1.4.2 樣品前處理 準確稱取已充分均質(zhì)樣品2.00 g于50 mL具塞試管中，加入8 mL 80%甲醇水溶液，渦旋震蕩2 min，超聲提取10 min，8 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至20 mL刻度玻璃管中。然后加入8 mL 80%甲醇水溶液重復提取一次，合并兩次提取液，用80%甲醇水溶液定容至20 mL。移取5 mL提取液，加入20 mL PBS溶液稀釋(稀釋2倍)，全部過免疫親和柱凈化。

取出免疫親和柱去掉上方塞子，安裝上轉(zhuǎn)接頭，將轉(zhuǎn)接頭另一端與針筒連接固定后使用。將柱子直接與氣控操作架上的針筒連接固定，處理后的溶液上樣，上樣結(jié)束后用6 mL 20%甲醇水溶液淋洗免疫親和柱，流速2～3滴/s，流干柱內(nèi)殘留液，并棄去以上全部流出液。最后用3 mL甲醇洗脫，流速1滴/s，洗脫液定容至4 mL，混勻后用0.22 μm有機微孔濾膜過濾后進行檢測。

1.4.3 NSP儀器檢測條件

(1) 色譜條件：色譜柱為Kinetex，XB-C18柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)；進樣體積5 μL；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；流動相A為去離子水(含50 mmol/L甲酸和2 mmol/L甲酸銨)；流動相B為95%乙腈水溶液(含50 mmol/L甲酸和2 mmol/L甲酸銨)；洗脫條件0.0 min(80% A)→5.0 min(10% A)→10.0 min(10% A)→10.1 min(80% A)→12.0 min(80% A)。

(2) 質(zhì)譜條件：檢測類型為電噴霧離子源，正離子掃描模式(Electrospray ionization，ESI+)；檢測方式為多反應監(jiān)測模式(Multiple Reaction Monitor，MRM)；毛細管電壓5 500 V；離子源溫度550 ℃；氣簾氣壓力206 kPa；霧化氣壓力345 kPa；輔助加熱氣壓力345 kPa；碰撞氣CAD中等流量；定量離子對895.4>877.4，碰撞能量26 eV；定性離子對895.4>859.6，碰撞能量30 eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫親和柱的制備

2.1.1 凝膠溶脹溶液體積的選擇 將2 g溴化氫活化的Sepharose CL 4B干粉分別加入15，20，25，30 mL 1 mmol/L的HCl溶液中溶脹。試驗結(jié)果顯示溶脹液體積在25 mL以下干粉溶脹不完全，因此選擇25 mL溶脹液對Sepharose CL 4B干粉進行溶脹。

2.1.2 偶聯(lián)反應方式 選用室溫溫和攪拌0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 h使其充分偶聯(lián)，經(jīng)測定室溫攪拌2～4 h的偶聯(lián)率均為100%，而攪拌1 h以下的偶聯(lián)率低于80%，所以選擇室溫偶聯(lián)時間為2 h。

2.2 免疫親和柱的應用優(yōu)化

2.2.1 稀釋緩沖液的確定 抗體對有機溶劑的敏感性是免疫親和柱凈化和富集過程中的一個重要因素，影響免疫反應的活性?？贵w對甲醇溶液有一定程度的耐受能力，若上樣液中甲醇濃度過高會破壞抗原抗體的結(jié)合。因此選擇適合的緩沖液稀釋是獲得高回收率的關(guān)鍵。PBS磷酸鹽緩沖溶液具有鹽平衡、可調(diào)整的適宜pH緩沖作用，所以選擇PBS樣品稀釋緩沖液。

以添加量為200 ng的扇貝樣品提取液為基準，用PBS進行不同倍數(shù)稀釋，通過比較不同稀釋倍數(shù)下樣品回收率，確定最佳稀釋比例。具體數(shù)據(jù)見圖1。

圖1 PBS不同稀釋比例對回收率的影響

由圖1可得，NSP免疫親和柱對甲醇的耐受能力在20%左右，隨著上樣液中甲醇濃度的增加，破壞了抗原抗體的特異性結(jié)合，使部分毒素結(jié)合不牢固而流失，造成樣品回收率降低。當樣品液∶PBS體積比為1∶4時樣品回收率達到90%以上。因此選擇稀釋比例為1∶4。

2.2.2 淋洗液的確定 考慮到PbTx-2的溶解性，為驗證淋洗過程中淋洗液(20%甲醇水溶液)是否會造成損失，收集全部6 mL(2 倍柱體積)淋洗液進行LC-MS/MS測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)淋洗過程中無損失，當淋洗液中甲醇濃度<20%時，不能使PbTx-2溶解，而當淋洗液中甲醇濃度>20%時，破壞了抗原抗體的特異性結(jié)合，PbTx-2的回收率明顯降低，故最終選擇6 mL 20%甲醇水溶液淋洗免疫親和柱。

2.2.3 洗脫液的確定 對PBS溶液進行加標(加標量200 ng)，不添加樣品基質(zhì)以排除基質(zhì)干擾，以水、50%甲醇水溶液、甲醇、2%氨水甲醇溶液作為洗脫液，做3組平行試驗，同時采用不同洗脫體積進行洗脫收集，以回收率為指標篩選出最佳洗脫液和洗脫體積，結(jié)果見表2。

表2 洗脫液對回收率的影響

由表2可知，用水、50%甲醇水溶液、2%氨水甲醇溶液洗脫時，PbTX-2的回收率分別為1.02%，57.11%，1.47%，回收率均偏低；分別用2，3，4 mL甲醇洗脫，回收率分別為74.27%，90.24%，89.38%。試驗表明：洗脫液體積≥3 mL時，PbTX-2能被洗脫出來。洗脫液體積過多時會造成試劑浪費，故最終選擇3 mL甲醇作為洗脫溶劑。

2.2.4 樣品提取試劑的確定 PbTx-2具熱穩(wěn)定性，易溶解于甲醇、乙醚等有機試劑，參考GB 5009.198—2016方法中對貝類樣品的提取試劑，同時考慮到DSP免疫親和柱的前處理過程[12]，試驗比較了20%甲醇水溶液、50%甲醇水溶液和80%甲醇水溶液的提取效率。提取加標量為200 ng的扇貝作為試驗對象，每種提取試劑做3次平行試驗，結(jié)果見表3。由表3可知，80%甲醇水溶液提取效率明顯優(yōu)于20%甲醇水溶液和50%甲醇水溶液。因此，選擇80%甲醇水溶液作為提取試劑。

表3 提取試劑對回收率的影響

2.2.5 方法檢出限、回收率及精密度結(jié)果 PbTx-2在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀上最佳響應濃度范圍為5，10，20，50，100，200，500 ng/mL，曲線方程y=10 236.300 37x-127 631，相關(guān)系數(shù)0.997 92。在曲線最低點濃度處(5 ng/mL)儀器的信噪比S/N=3，根據(jù)取樣量2 g、稀釋倍數(shù)為4，最終定容體積4 mL，計算得方法檢出限為40 μg/kg。圖2為20 ng/mL 的PbTx-2標準溶液在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀最佳狀態(tài)下得到的總離子流圖。由圖2可得， PbTX-2的總離子流圖峰形與響應良好且噪聲干擾小，能夠滿足檢測所需。

圖2 標準溶液的總離子流圖20 ng/mL PbTX-2

選擇陰性的扇貝和蛤蜊樣品為空白基質(zhì)，分別在3個濃度(檢出限、5倍檢出限、參考限量限)添加，每個濃度做6個平行樣品，按上述優(yōu)化方法進行試驗，計算得各添加水平對應的回收率和精密度，結(jié)果見表4。由表4可以看出，PbTx-2的平均回收率為82.95%～112.95%，相對標準偏差為1.27%～2.94%。方法的回收率與精密度可滿足PBTx-2的實驗室檢測要求。

表4 回收率和精密度結(jié)果

2.2.6 方法的實際應用 應用試驗法對各水產(chǎn)品市場采購蛤蜊、扇貝、貽貝、牡蠣4個品種40份樣品進行檢測，所檢測樣品中貝類毒素的含量均小于方法檢出限。有研究[1]表明，神經(jīng)性貝類毒素常見發(fā)生區(qū)域為美國沿岸、墨西哥灣沿岸和新西蘭沿岸。赤潮雖在中國沿海有分布，但尚未有檢測出該毒素樣品的報道。

3 結(jié)論

試驗建立了NSP免疫親和柱的制備和NSP毒素的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測法，通過研究NSP檢測方法中免疫親和柱的制備、樣品的提取和凈化、色譜質(zhì)譜條件，達到了檢測方法的檢出限低、穩(wěn)定性好、抗干擾能力強、定性定量結(jié)果準確的效果；彌補了現(xiàn)行國標(GB 5009.261—2016)方法的檢測周期長、操作過程相對復雜和無法定量等方面的不足。采用試驗方法檢測了4種中國常見水產(chǎn)品，與相關(guān)文獻[1]檢測結(jié)果基本相同。