李育敏，金瀟，張宇英，張力軍，陳亞瓊，覃俊龍，張秀明

(深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院a.醫(yī)學(xué)檢驗科，b.感染管理科，廣東深圳518001)

異常血紅蛋白病是由于珠蛋白基因缺陷導(dǎo)致珠蛋白分子的一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變引起的一組遺傳性血紅蛋白病[1]。血紅蛋白G(HbG)病于 1954 年由 Edington等[2]首次報道。我國流行病學(xué)調(diào)查顯示,在中國人群中發(fā)現(xiàn)的HbG種類有Hb G-Honolulu(Hb G-Chinese)、Hb G-Taipei、Hb G-Coushatta、Hb G-Waimanalo、Hb G-San José、Hb G-Siriraj和Hb G-Makassar等，南方地區(qū)以Hb G-Honolulu和Hb G-Taipei為主，北方以Hb G-Coushatta和Hb G-Taipei為主[3-10]。目前報道中國人群HbG病個別類型的臨床表型的案例較少[7,10]。鑒于不同類型的HbG可位于同一毛細(xì)管電泳分區(qū)內(nèi)，并可由α珠蛋白基因或是β珠蛋白基因缺陷所致，需通過DNA測序才能鑒定其類型，本研究通過篩查72 397例毛細(xì)管電泳樣本，對所檢出的異常血紅蛋白進行珠蛋白基因序列分析，總結(jié)和分析鑒定出的HbG的分子特征和血液學(xué)表型，為血紅蛋白疾病的篩查和遺傳咨詢提供參考。

1 對象和方法

1.1研究對象 連續(xù)選擇2016年6月至2019年5月來我院門診和住院且檢測血紅蛋白電泳者共72 397例。

1.2標(biāo)本采集 采集各研究對象就診時的外周靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，2～8 ℃保存，用于紅細(xì)胞參數(shù)，血紅蛋白電泳分析，地貧基因和DNA測序檢測。

1.3儀器與試劑 Capillarys2全自動毛細(xì)管電泳儀及其配套試劑 (法國Sebia公司)；XN-1000血細(xì)胞分析儀及其配套試劑(日本Sysmex公司)；T960擴增儀(中國黑馬公司)；ChemiDocTMMP全自動凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad公司)；DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)；YN-H16恒溫雜交儀及其配套試劑(深圳亞能公司)；3730XL遺傳分析儀(美國ABI公司)。

1.4血液學(xué)分析 采用毛細(xì)管電泳法進行血紅蛋白分析，電泳圖分為Z1～Z15區(qū)，分區(qū)鑒別Hb條帶的類型，并分析各條帶所占相對比例的含量。對毛細(xì)管電泳檢出的異常血紅蛋白樣本采用全自動血液分析儀進行各項紅細(xì)胞參數(shù)分析，檢測指標(biāo)為Hb、MCV和MCH。以上檢測均按照儀器及試劑盒說明書進行。MCV參考區(qū)間為82～100 fL，MCH參考區(qū)間為27～34 pg，Hb參考區(qū)間為成年男性：130～175 g/L；成年女性：115～150 g/L[11]。

1.5地貧基因檢測 對毛細(xì)管電泳檢出的異常血紅蛋白樣本采用Gap-PCR法檢測3種中國人群常見的缺失型α地貧基因(--SEA、-α3.7和-α4.2)；采用PCR-RDB法檢測常見的3種非缺失α地貧基因(αQS、αCS、αWS)和17種β地貧基因點突變類型(-28、-29、CD17、CD41-42、CD43、βE、CD71-72、IVS-Ⅱ-654、-32、-30、CAP、Initiation condon、CD14-15、CD27-28、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、CD31)。以上檢測操作及結(jié)果判讀均按照儀器及試劑盒說明書進行。

1.6珠蛋白基因序列分析 珠蛋白基因測序由深圳亞能公司檢測。對毛細(xì)管電泳檢出的異常血紅蛋白樣本采用PCR法擴增α1、α2和β珠蛋白基因[12-13]；采用Sanger雙脫氧鏈終止法進行珠蛋白基因序列測定；采用Vector NET 8.0軟件進行測序結(jié)果比對，于人類異常血紅蛋白和地中海貧血數(shù)據(jù)庫(http://globin.bx.psu.edu)查找突變位點。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HbG的分子特征 經(jīng)珠蛋白基因序列分析，共鑒定出6種異常HbG(圖1)，發(fā)生率為0.047%(34/72 397)，發(fā)生于α鏈的為Hb G-Honolulu(15例)和Hb G-Waimanalo(2例)，發(fā)生于β鏈的為Hb G-Taipei(9例)、Hb G-Coushatta(5例)、Hb G-San José(2例)和Hb G-Siriraj(1例)，其中3例為新生兒(2例Hb G-Taipei和1例Hb G-Coushatta)，其余均為成人。除1例Hb G-Honolulu合并βIVS-Ⅱ-654及αIVS-Ⅱ-55(G→T)突變雜合子(圖2A)，2例Hb G-Honolulu合并βIVS-Ⅱ-81(C→T)突變雜合子(圖2B)和1例Hb G-Honolulu合并αCD118(+TCA)突變雜合子(圖2C)外，其余均為單純HbG雜合子。

注：A，Hb G-Honolulu；B，Hb G-Waimanalo；C，Hb G-Taipei；D，Hb G-Coushatta；E，G-San José；F，Hb G-Siriraj；↓，突變位點。

注：A，IVS-Ⅱ-55；B，IVS-Ⅱ-81；C，CD118；↓，突變位點。

圖2 IVS-Ⅱ-55、IVS-Ⅱ-81和CD118突變的DNA測序結(jié)果

2.2血液學(xué)表型分析 成人各類型單純HbG雜合子、Hb G-Honolulu合并βIVS-Ⅱ-81突變雜合子和Hb G-Honolulu合并αCD118突變雜合子的Hb、MCV、MCH和HbA2均正常；Hb G-Honolulu合并βIVS-Ⅱ-654及αIVS-Ⅱ-55突變雜合子的MCV和MCH均降低,HbA2升高，以上各類型的HbG含量見表1。毛細(xì)管電泳分析示新生兒Hb G-Taipei的含量為(2.3±0.6)%；Hb G-Coushatta的含量為4.1%，其余見表2。

表1 成人不同HbG類型的血液學(xué)表型

注：*，以上指標(biāo)在本院檢驗科檢測；△，α鏈HbG的HbA2為HbA2+變異體，β鏈為HbA2。

表2 3例新生兒HbG雜合子的毛細(xì)管電泳分析

注：*，以上指標(biāo)在本院檢驗科檢測。

3 討論

本次研究共納入深圳地區(qū)72 397例樣本進行大規(guī)模的群體異常血紅蛋白病篩查，結(jié)果顯示HbG的發(fā)生率為0.047%，共發(fā)現(xiàn)了6種HbG類型，與我國南方地區(qū)HbG的種類分布相符合[3-7]。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)2種位于α鏈的HbG，分別為G-Honolulu和Hb G-Waimanalo，均為雜合子，以Hb G-Honolulu為主，占44.1%，發(fā)生率為0.021%。Hb G-Honolulu(Hb G Chinese)于1958年由Vella等[14]在新加坡華人中首次發(fā)現(xiàn)。筆者曾報道Hb G-Honolulu在深圳地區(qū)α鏈異常血紅蛋白中分布最高[7]。Hb G-Waimanalo于1971年由Blackwell等[15]首先在美國夏威夷具有菲律賓血統(tǒng)的人群中發(fā)現(xiàn)。兩者均廣泛分布于我國南方地區(qū)[3-7]。本研究顯示兩者的單純雜合子臨床表型均正常，HbG的含量均在23%左右，與HbVar記錄相符合。另外，本研究發(fā)現(xiàn)了1例Hb G-Honolulu合并βIVS-Ⅱ-654和αIVS-Ⅱ-55雜合突變，1例Hb G-Honolulu合并βIVS-Ⅱ-81雜合突變，以及1例Hb G-Honolulu合并αCD118雜合突變。βIVS-Ⅱ-654、αIVS-Ⅱ-55和βIVS-Ⅱ-81突變位點均發(fā)生于內(nèi)含子上。內(nèi)含子由于不形成翻譯產(chǎn)物，不受自然選擇的壓力，可能比外顯子累積更多的突變。而發(fā)生于珠蛋白基因非編碼內(nèi)含子區(qū)域的突變通常是影響mRNA剪切使珠蛋白鏈合成受限，因此，目前在HbVar 數(shù)據(jù)庫上記錄的影響血紅蛋白功能的大部分內(nèi)含子突變也位于剪接位點。IVS-Ⅱ-654(C>T)突變即是由于內(nèi)含子序列發(fā)生改變影響了轉(zhuǎn)錄后的正常剪切，產(chǎn)生異常剪接產(chǎn)物使β鏈合成減少，屬于β+地貧。IVS-Ⅱ-81突變(HBB:c.315+81C>T)在HbVar記錄發(fā)生于印度人群，可能為中性多態(tài)性位點。筆者[7]也曾報道1例Hb Queens合并βIVS-Ⅱ-81雜合突變，其表型正常。IVS-Ⅱ-55(G>T)突變尚未在HbVar記錄，但其突變發(fā)生于內(nèi)含子的非剪接位點。筆者[16]曾報道單純αIVS-Ⅱ-55雜合突變的臨床表型正常。以上研究提示αIVS-Ⅱ-55和βIVS-Ⅱ-81均可能為中性多態(tài)性位點，不影響珠蛋白基因的表達，其合并單純Hb G-Honolulu雜合子的臨床表型正常。因此，本例Hb G-Honolulu合并βIVS-Ⅱ-654和αIVS-Ⅱ-55攜帶者符合輕型β地貧特征，表現(xiàn)為MCV、MCH降低和HbA2升高，但其Hb G-Honolulu含量較單純Hb G-Honolulu雜合子降低，這可能與βIVS-Ⅱ-654雜合突變導(dǎo)致β珠蛋白基因表達減少有關(guān)。由于未進行家系調(diào)查，尚不清楚其Hb G-Honolulu和IVS-Ⅱ-55是否發(fā)生于同一條α鏈。同樣，本例Hb G-Honolulu合并βIVS-Ⅱ-81雜合突變的臨床表型正常。CD118突變(HBA1:c.357_358insTCA)發(fā)生于α1基因，在HbVar上未見記錄，但在中國人群中有報道，屬于α+地貧[1]。筆者[7]曾報道Hb Ube-2合并αCD118雜合突變的表型正常，表明CD118突變對珠蛋白基因的功能影響較小，其合并同樣不影響血紅蛋白功能的異常血紅蛋白的臨床表型正常。因此，本研究中的Hb G-Honolulu合并αCD118攜帶者的表型正常。

本研究發(fā)現(xiàn)位于β鏈的HbG有4種，分別為Hb G-Taipei、Hb G-Coushatta、Hb G-San José和Hb G-Siriraj，均為雜合子，以前兩者為主，各占26.5%和14.7%，發(fā)生率分別為0.012%和0.007%。Hb G-Taibei由Blackwell等[17]于1967年首先在中國臺灣漢族人群中發(fā)現(xiàn)；Hb G-Coushatta由Vella等[18]于1958年首先在美國印第安人群中發(fā)現(xiàn)；兩者廣泛分布于我國南方和北方地區(qū)[4-10]。本研究顯示Hb G-Taipei、Hb G-Coushatta、Hb G-San José和Hb G-Siriraj單純雜合子的臨床表型均正常，前三者HbG的含量均在40%左右，Hb G-Siriraj的含量相對較低，為32.3%，與HbVar記錄及王妍等[8]報道相符合。

本研究還發(fā)現(xiàn)了2例新生兒Hb G-Taipei雜合子，其HbG的含量為(2.3±0.6)%；以及1例新生兒Hb G-Coushatta雜合子，其HbG的含量為4.1%。新生兒地貧篩查是地貧防控的重要環(huán)節(jié)之一，本研究提供的臨床資料對新生兒血紅蛋白疾病的篩查具有參考價值：第一，不同年齡段的血液學(xué)參數(shù)不同，新生兒與成人的血紅蛋白條帶存在明顯差異；第二，臍帶血血紅蛋白電泳分析在新生兒地貧篩查中較傳統(tǒng)的紅細(xì)胞脆性試驗及血細(xì)胞分析篩查效果更佳[19]；第三，本研究顯示新生兒的以上兩種HbG的含量均較低，在(1.8～4.1)%之間，提示臨床應(yīng)注意鑒別新生兒HbG的毛細(xì)管電泳特征，必要時可做DNA測序鑒定其類型，并與其他異常血紅蛋白進行區(qū)別。