王煒為，高 晗，李文濤

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院 上海 200071）

帕金森?。≒arkinson's Disease，PD）是最常見的進(jìn)行性中樞神經(jīng)退行性病變之一，是老年人常見的以黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)多巴胺功能不足為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。以震顫、強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩、步態(tài)姿勢(shì)異常等運(yùn)動(dòng)癥狀和抑郁、便秘、嗅覺減退等非運(yùn)動(dòng)癥狀為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。該病多發(fā)生于50歲以上的老年人，發(fā)病率隨著年齡增長(zhǎng)而增加，在60歲以上的人群中發(fā)病率達(dá)1%，80歲以上人群中發(fā)病率達(dá)3%[3]。目前，治療帕金森病的藥物有左旋多巴、單胺氧化酶B 抑制劑、多巴胺受體激動(dòng)劑、兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑等，主要用于改善帕金森患者的癥狀和生活質(zhì)量[4,5]。中晚期藥效逐漸減退，并發(fā)癥逐漸顯現(xiàn)。這些藥物無(wú)法改善受損的多巴胺能神經(jīng)元功能，也不能減緩黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的退變。手術(shù)治療雖然可作為中晚期治療的手段，但由于是侵入性治療，且成本高，使臨床應(yīng)用受到一定的限制[6]。嚴(yán)格的說，目前尚無(wú)臨床有效的神經(jīng)保護(hù)藥物。

帕金森病屬于中醫(yī)“顫病”的范疇，肝腎虧虛是帕金森病的根本因素，補(bǔ)益肝腎藥物在臨床中應(yīng)用廣泛并取得較好療效[7]。補(bǔ)腎止顫方來(lái)源于經(jīng)典補(bǔ)腎名方六味地黃丸，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)六味地黃丸治療帕金森病有較好的效果[8-10]，且我們經(jīng)過前期研究發(fā)現(xiàn)加味止顫湯（即止顫湯加補(bǔ)腎藥）對(duì)帕金森病有一定的治療作用，對(duì)非運(yùn)動(dòng)癥狀療效更為顯著[11]。在臨床中我們發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎止顫方可以延緩疾病發(fā)展，可能有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。因此本研究采用6-羥基多巴胺（6-OHDA）兩點(diǎn)注射法建立PD 模型，通過檢測(cè)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量以及中腦多巴胺及其代謝產(chǎn)物的水平，旨在進(jìn)一步揭示補(bǔ)腎止顫方對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)保護(hù)作用，為臨床上補(bǔ)腎止顫方治療帕金森病提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重180-220 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，SPF級(jí)，合格證編號(hào)：2015000513953，許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2012-0002。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

補(bǔ)腎止顫方顆粒劑，成分：熟地、山茱萸、山藥、肉蓯蓉，由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展公司提供。大鼠補(bǔ)腎止顫方用量：大鼠體表面積轉(zhuǎn)換公式為6.3 × 成人用量 mg·kg-1，補(bǔ)腎方人體用量為 48 mg·d-1，大鼠灌胃量為504 mg·(kg·d)-1。

1.3 主要試劑與儀器

6-OHDA，抗壞血酸，阿撲嗎啡（APO）（均購(gòu)自sigma，美國(guó)），多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（DAT）抗體（北京博奧森生物科技有限公司，批號(hào)：bs-20080R）和酪氨酸羥化酶（TH）抗體（北京博奧森生物科技有限公司，批號(hào)：bs-1714R），兔抗體免疫組化SP 試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：KGSP03），大鼠3,4-二羥基苯乙酸（DOPAC）、5-羥色胺（5-HT）、高香草酸（HVA）、單胺氧化酶B（MAO-B）、絡(luò)氨酸羥化酶(TH)、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（DAT）的ELISA 試劑盒（上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司）。ZH-藍(lán)星B 型腦立體定位儀（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司），10μL微量注射器（高鴿微量注射器，長(zhǎng)沙市天心區(qū)雷磁儀器商行），正置熒光顯微鏡（德國(guó)LEICA，DM2500）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 PD模型建立

SD 大鼠用10%水合氯醛（3.5 mL·kg-1）腹腔注射麻醉后，將其頭部水平位固定于腦立體定位儀上，剪除顱頂鼠毛，用碘酒、酒精消毒皮膚，沿中線切開頭皮，充分暴露顱頂前囟，參照Paxinos 和Watson 主編的《大鼠腦立體定位圖譜》，保持前后囟水平，以前囟為坐標(biāo)，確定右側(cè)黑質(zhì)致密部定位坐標(biāo)：前囟后4.8 mm，矢狀縫右側(cè)1.8 mm，顱骨下8.2 mm；右側(cè)中腦腹側(cè)被蓋區(qū)定位坐標(biāo)為：前囟后4.8 mm，中線右側(cè)1.0 mm，顱骨下8.2 mm。黑色記號(hào)筆標(biāo)記。牙科鉆小心鉆透定位處的顱骨，暴露硬腦膜，按以上坐標(biāo)將微量注射器針緩慢進(jìn)針到預(yù)定深度，向黑質(zhì)致密部和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)注射配置好的6-OHDA（2 mg·mL-1）各 5 μL（含0.2%抗壞血酸），垂直入顱，緩慢進(jìn)針，注射保持速度為1 μL·min-1，留針10 min，緩慢退針1 mm·min-1，術(shù)中觀察大鼠生命體征。常規(guī)縫合皮膚，3 天連續(xù)腹腔注射青霉素5×104U 以防止感染。造模3 周后，腹腔注射0.1%阿撲嗎啡（0.5 mg·kg-1），檢測(cè)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)的圈數(shù)，大于每分鐘7 圈，為造模成功[12]，選取造模成功的80只模型大鼠和20只正常大鼠用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

將大鼠分為正常組、模型組、補(bǔ)腎止顫方顆粒低劑量組（生藥1.26 g·kg-1）、補(bǔ)腎止顫方顆粒中劑量組（生藥2.52 g·kg-1）、補(bǔ)腎止顫方顆粒高劑量組（生藥5.04 g·kg-1），每組 20 只。根據(jù)不同分組，補(bǔ)腎止顫方顆粒按照不同劑量溶于生理鹽水中，每天中午灌胃1次。正常組和模型組予以相同體積的生理鹽水灌胃。分別在造模成功后（即造模后3 周）給藥，在給藥第10天和第20天分別檢測(cè)行為學(xué)和取材。

2.3 行為學(xué)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)大鼠在最后1 次灌胃給藥后，腹腔注射0.1%阿撲嗎啡（0.5 mg·kg-1）誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為（誘發(fā)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)）。于阿撲嗎啡注射后5 min 開始記錄，共記錄30 min。

2.4 多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量檢測(cè)

免疫組化法檢測(cè)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元標(biāo)志物DAT和TH蛋白表達(dá)。每組隨機(jī)取5只大鼠，心臟灌流固定后取腦，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

2.4.1 腦組織的灌流固定

按大鼠體重，用10%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，血管鉗固定后剪開右心耳，先向左心室快速注射生理鹽水150 mL，然后用4%多聚甲醛約250 mL灌注固定，先快后慢，大鼠會(huì)出現(xiàn)四肢、尾的抽搐，最終以肝臟發(fā)白、內(nèi)臟鼓起、四肢頸項(xiàng)僵直即灌注好。斷頭，取腦，置于4%多聚甲醛固定液中，在4℃冰箱內(nèi)保存。

2.4.2 石蠟切片的制備

將腦組織標(biāo)本從固定液中取出，在黑質(zhì)部沿冠狀面切開腦組織，約2 mm。經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋腦組織后進(jìn)行石蠟切片，片厚為6 μm，每個(gè)腦組織選取3張切片進(jìn)行免疫組化染色。

2.4.3 免疫組化染色（按照免疫組化試劑盒說明書）

脫蠟、入水、抗原修復(fù)后，3%H2O2-甲醇室溫孵育10 min，去除內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS（Phosphate buffer saline）洗 5 min/次 × 3 次；用 10% 山羊血清封閉液封閉10 min，以減少非特異性吸附；吸出封閉血清，加入稀釋好的一抗，一抗為兔抗TH 多克隆抗體（1∶200）和兔抗DAT 多克隆抗體（1∶200），室溫下孵育 1 h 或 4℃孵育過夜。吸出一抗；PBS 洗，5 min × 3次；加抗兔生物素化二抗，室溫孵育1 h；PBS 洗5 min×3 次；加辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記鏈親合素，室溫孵育10 min；PBS洗，5 min×3次。用DAB工作液顯色2-5 min，顯微鏡下控制染色程度，自來(lái)水終止顯色反應(yīng)；蘇木素復(fù)染。PBS充分沖洗后，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察黑質(zhì)中TH和DAT表達(dá)陽(yáng)性的神經(jīng)元。

2.4.4 結(jié)果分析

光鏡下觀察大鼠DAT、TH 的變化。在20 倍物鏡下拍照，選取兩個(gè)視野，計(jì)數(shù)右側(cè)黑質(zhì)致密部DAT、TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)面積，將每只大鼠的腦片取平均值為最后該大鼠DAT、TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)面積。

2.5 腦內(nèi)多巴胺及代謝產(chǎn)物

ELISA 法檢測(cè)：行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，每組隨機(jī)取10 只大鼠，分別在第10 天和第20 天直接取腦，用于ELISA檢測(cè)。取右側(cè)黑質(zhì)，加入一定量的PBS 勻漿。離心20 min，2500 r·min-1。仔細(xì)收集上清。分在酶標(biāo)包被板上設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品，加樣，用封板膜封板后置37℃溫育30 min。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。然后，每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外。再次溫育、洗滌，方法同上。接下來(lái)顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。最后測(cè)定：空白孔調(diào)零，450 nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（Optical density,OD）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 min以內(nèi)進(jìn)行。

圖1 各組大鼠行為學(xué)變化

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 補(bǔ)腎止顫方對(duì)PD大鼠模型旋轉(zhuǎn)行為的改善作用

在建立帕金森大鼠模型后3 周，阿撲嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)，每分鐘轉(zhuǎn)圈數(shù)大于7 圈的為造模成功，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。隨著時(shí)間的增加，模型組大鼠轉(zhuǎn)圈數(shù)逐漸增加；補(bǔ)腎止顫方處理后，PD 大鼠轉(zhuǎn)圈數(shù)減少。和模型組相比，低劑量組在治療第10 天轉(zhuǎn)圈數(shù)無(wú)明顯差異，在第20天轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯減少（P＜0.05）；中劑量組和高劑量組PD 大鼠在第10 天轉(zhuǎn)圈數(shù)明顯減少（P＜ 0.05），且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在第20 天，補(bǔ)腎止顫方組和模型組相比優(yōu)勢(shì)更加明顯（P＜0.01）。另外中劑量組轉(zhuǎn)圈數(shù)在第10 天和20 天之間沒有差距，而高劑量組20 天比10 天轉(zhuǎn)圈數(shù)減少（圖1），說明在治療一段時(shí)間后加大中藥的劑量可能對(duì)帕金森的治療更有益處。以上結(jié)果表明補(bǔ)腎止顫方能夠改善PD 大鼠的行為學(xué)，中高劑量療效較好。

3.2 補(bǔ)腎止顫方對(duì)PD 大鼠模型腦內(nèi)多巴胺神經(jīng)元數(shù)量的影響

圖2 免疫組化法檢測(cè)不同組別右側(cè)大腦黑質(zhì)區(qū)DAT和TH陽(yáng)性細(xì)胞

表1 免疫組化法和ELISA檢測(cè)不同組別右側(cè)大腦黑質(zhì)區(qū)DAT和TH表達(dá)水平

PD 大鼠經(jīng)過相應(yīng)的處理后，分別在第10 天和第20 天免疫組化和ELISA 法檢測(cè)右側(cè)黑質(zhì)區(qū)TH 和DAT的表達(dá)情況。TH 是多巴胺合成的限速酶，DAT 將神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺從突觸間隙泵出回細(xì)胞質(zhì)，TH 和DAT的表達(dá)量可以反映多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量。研究結(jié)果如下（圖2、表1）：兩種檢測(cè)方法均顯示PD 模型組右側(cè)黑質(zhì)區(qū)TH 和DAT 的表達(dá)較正常組明顯下降（P＜0.01），說明造模成功。補(bǔ)腎止顫方治療后，TH 和DAT的表達(dá)水平較模型組升高，尤其是中劑量組和高劑量組（*P＜ 0.05，**P＜ 0.01）。說明補(bǔ)腎止顫方能夠增加PD大鼠模型多巴胺能神經(jīng)元的表達(dá)。

3.3 補(bǔ)腎止顫方對(duì)PD模型大鼠腦內(nèi)代謝產(chǎn)物的影響

ELISA 法檢測(cè)大鼠腦內(nèi)相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化情況，HVA 和DOPAC 是多巴胺代謝產(chǎn)物，可以反映多巴胺水平；5-HT 與運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能密切相關(guān)；而MAO-B是多巴胺分解代謝過程中的關(guān)鍵酶之一，可產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。結(jié)果顯示（表2）：PD 大鼠造模后，5-HT、DOPAC 和 HVA 的表達(dá)均降低，MAO-B 的表達(dá)升高（##P＜ 0.01）。補(bǔ)腎止顫方處理后，5-HT、DOPAC 和 HVA 的表達(dá)較模型組升高，MAO-B 的表達(dá)相對(duì)降低，尤其是中高劑量組（*P＜ 0.05，**P＜ 0.01）。這個(gè)結(jié)果表明補(bǔ)腎止顫方能夠增加代謝產(chǎn)物DOPAC、5-HT、HVA 的表達(dá)且抑制 MAO-B 的表達(dá)，保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元。

表2 大鼠右側(cè)黑質(zhì)致密部DOPAC、5-HT、HVA含量

4 討論

帕金森病盡管臨床癥狀多樣，根本原因還是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的缺失。目前的治療方法均以改善癥狀為主，神經(jīng)修飾治療的藥物沒有被指南推薦，說明還缺乏多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)的藥物，而只有神經(jīng)保護(hù)治療才有可能阻止或延緩疾病的發(fā)展，是帕金森病的根本性治療。

帕金森病屬中醫(yī)顫病范疇，病機(jī)虛實(shí)夾雜，錯(cuò)綜復(fù)雜，抓住根本病機(jī)施治，是對(duì)帕金森病進(jìn)行根本治療的關(guān)鍵。早在《內(nèi)經(jīng)》中就有“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”的記載，認(rèn)為肝腎虧虛是震顫類疾病的根本內(nèi)因[13]。臨床薈萃分析的證候研究也發(fā)現(xiàn)，“肝腎虧虛”是帕金森病最主要的證候[14]。肝腎同源，肝腎陽(yáng)虛較少，肝腎虧虛以肝腎陰精不足為主要原因。臨床研究也證明，在帕金森病患者中腎陰虧虛為主要證候要素[15]。臨床研究表明補(bǔ)腎陰經(jīng)方如六味地黃丸可以改善帕金森病患者的運(yùn)動(dòng)及非運(yùn)動(dòng)癥狀[10]，顯示出一定的治療帕金森病的作用。該方補(bǔ)腎陰為主，切中帕金森病的根本病機(jī)，可能有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，減緩帕金森病發(fā)展的作用。

補(bǔ)腎止顫方來(lái)源于經(jīng)典補(bǔ)腎名方六味地黃丸，我們?cè)谂R床中發(fā)現(xiàn)其對(duì)帕金森病人有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證補(bǔ)腎止顫方治療帕金森的機(jī)理，本研究采用6-OHDA 兩點(diǎn)注射法建立PD 模型。因?yàn)榧y狀體多巴胺系統(tǒng)破壞后，突觸后膜的多巴胺受體因失神經(jīng)支配而敏感性增高，此時(shí)應(yīng)用多巴胺受體激動(dòng)劑使損傷側(cè)興奮作用占優(yōu)勢(shì)而產(chǎn)生向健側(cè)旋轉(zhuǎn)。因此在模型構(gòu)建3周后，利用多巴胺受體激動(dòng)劑-阿撲嗎啡誘導(dǎo)大鼠轉(zhuǎn)圈，并以大鼠旋轉(zhuǎn)圈數(shù)大于每分鐘7圈為指標(biāo)以確定造模成功與否。結(jié)果表明，造模后大鼠轉(zhuǎn)圈數(shù)增加，同時(shí)，TH、DAT、DOPAC、HVA 及5-HT的表達(dá)均下降而MAO-B 的表達(dá)增加。經(jīng)補(bǔ)腎止顫方干預(yù)后，我們發(fā)現(xiàn)不同劑量的補(bǔ)腎止顫方均顯示了較好的改善PD 模型大鼠旋轉(zhuǎn)行為的作用，以中高劑量療效為著，說明補(bǔ)腎止顫方可以減輕PD 大鼠多巴胺系統(tǒng)的損毀程度，改善PD大鼠的行為學(xué)（圖1）。

為了進(jìn)一步明確補(bǔ)腎止顫方對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的作用，分別用免疫組化法和ELISA 法檢測(cè)TH 和DAT 的表達(dá)情況。絡(luò)氨酸羥化酶（TH）是多巴胺合成的限速酶，它在黑質(zhì)紋狀體的水平直接影響多巴胺的合成[16]；多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（DAT）是一種跨膜蛋白，將神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺從突觸間隙泵出回細(xì)胞質(zhì)[17]。因此，TH 和DAT 的表達(dá)在一定程度上代表了多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量。免疫組化結(jié)果顯示補(bǔ)腎止顫方中劑量組（10天）和高劑量組（20 天）中TH 和DAT 的表達(dá)較模型組明顯升高（P＜ 0.01）（圖2、表1）。另外，ELISA 結(jié)果同樣顯示補(bǔ)腎止顫方可以提高TH 和DAT 的表達(dá)水平，說明其能夠促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元的表達(dá)（表1）。

多巴胺代謝過程中有許多代謝產(chǎn)物直接或間接影響帕金森患者的癥狀。DOPAC 是神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的代謝產(chǎn)物，在單胺氧化酶和多巴胺兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）催化下降解為高香草酸（HVA），HVA可以反映大腦中的多巴胺水平，HVA 在腦脊液中的濃度與運(yùn)動(dòng)損傷相關(guān)，并且它可能是PD 期的合適標(biāo)志物[18]。廣泛的含5-HT 神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)涉及許多生理事件的調(diào)節(jié)，如激素分泌，睡眠-覺醒周期，運(yùn)動(dòng)控制，意識(shí)，學(xué)習(xí)，記憶等[19]。人們普遍認(rèn)為5-HT 會(huì)引起幸福感[20]，且由于其復(fù)雜但關(guān)鍵的調(diào)節(jié)特性，5-HT 被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要協(xié)調(diào)者之一，在運(yùn)動(dòng)活動(dòng)中具有非常重要的作用[21]。因此，5-HT的減少可能會(huì)導(dǎo)致帕金森患者活動(dòng)、記憶、睡眠障礙及抑郁情緒等癥狀的發(fā)生。單胺氧化酶B（MAO-B）是多巴胺分解代謝過程中的關(guān)鍵酶之一，催化芳基烷基胺神經(jīng)遞質(zhì)的氧化并產(chǎn)生活性氧，可以導(dǎo)致細(xì)胞損傷[22]。本次研究結(jié)果顯示：補(bǔ)腎止顫方可以促進(jìn)PD 模型多巴胺代謝產(chǎn)物 5-HT、DOPAC 和 HVA 的表達(dá)水平，而降低 MAO-B水平（表2），一方面表明補(bǔ)腎止顫方可以增加帕金森病大鼠多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量，另一方面顯示出其增效減毒的作用，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用，契合了該藥補(bǔ)腎治本的作用機(jī)制。

綜上所述，補(bǔ)腎止顫方能夠改善帕金森大鼠的行為學(xué)，增加帕金森病大鼠多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量，并維持多巴胺能神經(jīng)元功能，降低神經(jīng)損傷，有較好的神經(jīng)保護(hù)作用。